Рассечение сердца: Метод наблюдения за сердечной развитием зебры

Overview

Это видео описывает технику изоляции сердца от зебры на нескольких стадиях развития для изучения развития сердца, созревания и старения.

Protocol

1. Измерение рыбы и вскрытие

1. Поместите одну рыбу в чашку Петри наполовину заполненную свежим PBS и положите ее на правую сторону.
2. Измерьте длину рыбы от морды до основания хвоста (хвостовой фронтонкул), не включая хвостовые плавники, используя цифровой мм калипер(рисунок 1). Это стандартная длина (SL).
3. Каждой рыбе может быть присвоено сочетание числа/письма, чтобы позволить отдельной рыбе и полученному расчленению сердца отслеживаться для более длительного анализа. Данные, включая номер родительского фонда, возраст фиксации, измерения SL, были внесены в электронную таблицу и организованы на основе этих меток.
4. Перед вскрытием, этикетка ПЦР трубки полосы с назначенным номером отслеживания и заполнить PBT или другое решение, подходящее для дальнейшего анализа.
5. Ориентация рыбы брюшной стороне в чашке Петри при стабилизации тела с типсами проведения голову между глазами и жабры (Рисунок 1).

Меньше рыбы (меньше, чем 12 мм SL):

6. а) Использование острых типсов, или микро-иглы в держатель булавки, удалить грудные мышцы и плавники из тела, чтобы выявить сердце. Постоянное движение типсов во время вскрытия может вызвать токи в PBT, которые перемещают рыбу. Это особенно проблематично для мелких рыб, таким образом, микро-игла может быть использована для удаления грудных мышц и плавников и открыть полость тела.
7. а) Аккуратно используйте типсы, чтобы вычерпыть сердце из полости из-под атриума. Кроме того, в некоторых рыб вы можете быть в состоянии удалить сердце, осторожно потянув луковичные, а остальная часть сердца будет следовать. Будьте осторожны с расположением атриума, если с помощью этой техники, как он может быть легко поврежден. Если есть дополнительные ткани, которая поставляется с сердцем, что хорошо и может быть очищен после.
8. а) Если рыба содержит флуоресцентный сердечный маркер, такой как Tg(myl7:GFP)^twu34, используйте флуоресцентные возможности для вскрытия и проверить удаление сердца флорескции (Рисунок 2).
9. а) Как только сердце удаляется из полости, используйте типсы, чтобы держать сердце и микро-иглу, чтобы удалить дополнительные некардиальной ткани и эпикардиальной подкладке с внешней стороны сердца.

Большая рыба (больше, чем 12 мм SL):

6. б) Использование пружины обрабатываются микро-ножницы, сделать три разреза менее 1 мм глубиной: 1 поперечный разрез через жабры 2 поперечный разрез на передней части живота 3- sagittal вырезать на брюшной стороне подключения обоих сокращений (Рисунок 3).
7. б) Использование резких типсов удалить грудные мышцы и плавники из тела, чтобы открыть полость тела и выявить серебристой ткани перикарда(рисунок 4A). Удалить эту перикардиальной ткани и сердце станет видимым (Рисунок 4B).
8. б) Используйте микро-ножницы, чтобы сократить артерии подключены к луковичные артерии, расположенные выше сердца. После того, как эта артерия вырезать, положить миппы советы под атриум, использовать типсы, чтобы зачерпнуть сердце из полости. Если есть дополнительные ткани, которая поставляется с сердцем, что хорошо и могут быть удалены позже.
9. б) Как только сердце удаляется из полости, используйте два типса, чтобы держать сердце и удалить дополнительные ткани, или одну пару типсов, чтобы держать сердце и микро-иглу, чтобы удалить дополнительные, не сердечной ткани. Эпикардиальная подкладка, о чем свидетельствует его черная пигментация, может быть удалена из внешней части сердца при желании путем мягкого соскабливания ткани.

Representative Results

Рисунок 1. Держите рыбу с типсами между глазами и жабры.

Рисунок 2. Сердечный специфический флуоресцентный трансгенный маркер, такой какTg (myl7:GFP)^twu34, показанный здесь, может помочь в визуализации сердца, расчлененного из мелких рыб.

Рисунок 3. Три разреза для удаления грудных мышц и кожи: 1 поперечный разрез через жабры 2 поперечный разрез на передней части живота 3- sagittal разрез на брюшной стороне подключения обоих разрезов.

Рисунок 4. Черные буквы маркировать камеры сердца: луковичные артерии (ба), желудочек (v), и атриум (а).
A- Верхняя полость тела открыта, чтобы показать серебристую ткань перикардия.
B- После удаления перикардия, сердце видно и легко удаляется.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps #55	Fine Science Tools	11295-51
Micro-scissors	Fine Science Tools	15005-08
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Micro-needles	Fine Science Tools	10130-10
Petri dishes	BD Biosciences	351029