Summary
O sapo
Abstract
Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.
Protocol
1. Animais
X. laevis x X. Gilli híbridos LG-6 e LG-15 isogenetic clones 1 são da nossa colônia de reprodução da Universidade de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 compartilham o mesmo haplótipo heterozigoto MHC (a / c), mas diferem em menores de histocompatibilidade (H) loci. Progênie desses clones são produzidos por gynogenesis, em que os ovos diplóides produzido pela fêmea são ativados por UV-irradiados esperma (não há contribuição de DNA para os descendentes).
O uso de luvas é facultativa. Algumas pessoas preferem não usá-los porque é mais difícil lidar com as rãs (escorregadio) e de fato parece fazer as rãs desconfortável.
2. Purificação da gp96 de 15 / 0 Tumor (expressa tanto Tumor e Menores H-Ags)
Gp96 purificação foi descrito anteriormente 2, 3. Resumidamente, gp96 é purificada por fracionamento 50-70% sulfato de amônio, seguido de ConA-Sepharose e cromatografia DEAE. Cerca de 20-50 mg de proteína pode ser obtida por 1 mL de tecido do tumor. Pureza da preparação é determinado por SDS-PAGE e coloração lasca.
3. Elicitação e Colheita de Leucócitos Peritoneal (PLs) de Minor H-Ag-díspares LG-6 Frogs
- Crescer uma noite para o dia 25 mL E. Cultura coli em um tubo de 50 ml a 37 ° C com agitação.
- O calor dia seguinte matar as bactérias pela fervura por 1 hora.
- Centrifugar o calor matou E. Coli por 15 min a 2.000 rpm (1.500 g) a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de bactérias em 1 / 10 º volume da cultura original (2,5 mL) em APBS. Neste ponto, a cultura bacteriana está pronto para uso e deve ser usado dentro de 24 horas.
- Injetar por via intraperitoneal (ip) 200 (para um sapo 2 polegada) ou 300 mL (para um sapo de 3 polegadas) da preparação de calor matou bacteriana por sapo usando um calibre 25 08/05 agulha.
- Três dias após a injeção PLs são colhidas por lavagem intraperitoneal.
- Antes da colheita PL, sapos adultos são anestesiados por imersão em uma solução aquosa de 0,1% tricaina sulfonato metano (TMS, MS-222) tamponada com bicarbonato de sódio para até 5 min até que todo o movimento cessa (duração depende do tamanho e idade). Animais acordar dentro de 10-20 min após o tratamento.
- Desinfectar o abdômen do sapo com uma pequena quantidade de etanol a 70%.
- Injetar 5 mL (para um sapo 2 polegadas) ou 10 mL (para um sapo de 3 polegadas) de APBS estéril pré-aquecido em temperatura ambiente para a cavidade peritoneal através de um calibre 18 1 ½ agulha. Remova a agulha e massagear suavemente o sapo por um minuto para assegurar que o buffer injetado equilibra com o líquido na cavidade do corpo.
- Use um medidor de 18 novos 1 ½ agulha sem uma seringa para coletar o líquido peritoneal que vai pingar na parte de trás da agulha em um tubo limpo de 50 mL cônico. Certifique-se de recuperar o máximo de volume inicial injetado possível. Ter cuidado para evitar os vasos sanguíneos na área central da região abdominal.
- Uma vez que PLs são colhidas colocar o sapo em um recipiente com água rasa até que seja acordado em que ponto ele pode ser colocado de volta em sua gaiola.
4. Transferência pulsante e adotiva do Lg-6 Pls Em Naive Lg-6 Destinatários
- Lavar os PLs uma vez com APBS frio e centrifugar-los a 1.000 rpm (750 g) por 10 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o PLs em APBS.
- O pulso do PL com gp96 em uma concentração de 1 mg gp96 por 5 x 10 5 PLs.
- Uma vez que a quantidade adequada de gp96 é adicionado ao PLS, misturá-los por pipetagem e incubar no gelo por 1 hora.
- Centrifugar as células ou a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C ou menos 14.000 rpm por 1 min para remover qualquer unbound gp96.
- Lavar os PLs 3X com APBS fria para garantir que não haja deixado gp96 residual.
- Ressuspender o PLs pulsado a uma concentração de 5 x 10 5 PLs por 300 mL.
- Adotivamente transferência PLs por injeção ip usando calibre 25 08/05 agulha. Injetar 300 mL de PLs pulsado (5 x 10 5 células) por animal.
- Rãs precisam ser preparadas pelo menos três dias antes de continuar com enxerto de pele ou experiências desafio tumor.
5. Ensaio de enxerto de pele
Rejeição do enxerto de pele é um ensaio bem estabelecido em Xenopus 4, 5, 6. Em Xenopus, um destinatário rejeita a pele do doador exibir 1 ou 2 desencontros haplotipo MHC dentro de 18-22 dias a 21-22 ° C. Em contraste, enxertos de pele entre a LG ea LG-6-15 clones que diferem apenas por menores H-Ags são rejeitados mais lentamente (mais que 30 dias). No entanto, essa rejeição é acelerado em receptores that foram imunizadas contra doadores menores H-Ags quer por um enxerto de pele anterior ou pela imunização com gp96 purificada do doador. Sem rejeição em todos ocorre quando o dador eo receptor são geneticamente idênticos (por exemplo, animais clonados ou totalmente puras). Portanto, esta técnica simples é muito poderosa para a caracterização in vivo respostas imunes induzidas pela gp96.
- Anestesiar sapo doador, conforme descrito em 3.7.
Nota: Apenas as precauções mínimas precisam ser tomadas desde Xenopus produzir potente anti-microbial peptídeos (por exemplo, magainin) na pele que elimina a necessidade para o total de procedimentos assépticos. Na verdade, o tratamento do sapo com qualquer desinfetante seria prejudicial para a pele. Além disso, Xenopus não têm qualquer patógenos que podem ser transferidos para os seres humanos. Portanto, o uso de luvas é opcional. No entanto, todos os instrumentos usados dissecção precisa ser autoclavados e todas as soluções precisam ser esterilizados. - Corte e retire uma pequena (20 mm X 5 mm) pedaço de pele ventral (pele abdominal que aparece prateado, devido à presença de irridophore células pigmentadas) de um sapo doador LG-15 com uma tesoura.
- Coloque a pele em uma APBS petridish contendo e mantê-lo no gelo. Manipular o tecido da pele muito gentilmente, evite segurá-lo entre fórceps.
- Usando uma navalha ou tesoura corte enxertos individuais em 5 mm X 5 peças mm. Manter os fragmentos em APBS no gelo.
- Neste ponto, o sapo doador é colocado em um recipiente com água rasa até que seja acordado e, em seguida, ele é colocado em água contendo antibióticos (Penstrep na concentração de 5 mg / L). O sapo é mantido em água com antibióticos durante dois dias em que ponto ele é devolvido em água normal. A pequena ferida no local onde a pele foi removida não precisa ser costurada e cura em uma semana.
- Anestesiar o destinatário sapo LG-6.
- Fazer uma pequena incisão na pele (costas) dorsal do destinatário e insira os 5 mm X 5 mm de enxerto sob a pele com o lado prateado para cima. Tenha cuidado para não introduzir grandes bolhas de ar sob a pele, porque isso pode levar ao deslocamento ou mesmo perda do enxerto.
- Certifique-se de observar as marcações tesoura e uma pinça na enxertos porque aqueles não são contados como rejeição do enxerto, uma vez o placar começa.
- 24 horas mais tarde uma parte da pele do hospedeiro sobrepondo precisa ser removido do enxerto.
- Anestesiar o destinatário sapo LG-6. Lidar com o animal, como descrito em 5.1.
- Com uma tesoura esterilizada cortar uma janela ao redor do enxerto, para que o enxerto pode ser livremente visualizado. Tenha cuidado para não tocar a pele do doador ou para induzir o sangramento. Vamos recuperar o sapo como descrito em 5.5.
- Começar a marcar o enxerto de imediato, tomando um esboço. Rejeição do enxerto de pele é determinada pela porcentagem de destruição da irridophores na pele enxertada.
- Os enxertos precisam ser verificados a cada 2-3 dias, mas os animais não precisam de ser anestesiado para isso. Para visualizar os enxertos, os sapos precisam ser colocados em um petridish sob um microscópio de dissecação.
6. Toda montagem de imuno-histologia pele transplantada
Sapo todo-mount imuno-histologia foi descrita anteriormente 6. Resumidamente, o sapo é anestesiado e colocado sob o microscópio em uma toalha de papel estéreis pré-molhada com água sapo (a área de trabalho também é preparado em condições assépticas). A pele transplantada é então retirada junto com uma pequena quantidade de pele circundante do host e é corado com anticorpos semelhante à coloração de células para análise de citometria de fluxo 6. Instrumentos autoclavados e buffers estéreis devem ser usados. Após a coloração da pele é colocada sobre uma lâmina de microscópio e delicadamente pressionado com uma lamínula. Neste ponto, a pele pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência para diferentes populações de células que se infiltraram o enxerto. Após o procedimento o sapo é mantido em água com antibióticos, como descrito na seção 5.5. e voltou em água normal. A pequena ferida esquerda, onde a pele foi removida cicatriza em uma semana.
7. Caracterização de leucócitos do sangue
- Antes de remover o sangue do sapo, é preciso preparar "agulhas de vidro" puxando pipetas Pasteur estéreis sobre chama. A extremidade fina da pipeta está afiada sob o estereomicroscópio. A pipeta é então ligado a um tubo de plástico aspiração.
Todos os instrumentos, como a pinça e tesouras precisa ser autoclavados antes do uso. - Também preparar 10 mL de gelo frio do APBS e solução de heparina pela adição de 50 unidades de heparina por 1 mL de APBS. Mantenha a solução em gelo. Todas as soluções utilizadas devem ser estéreis.
- Anestesiar sapo como descrito em 3.7, e seguir os procedimentos mesmo animal manuseio, como descrito em 5.1. .
- Cortar a pele acima do pé posterior para expora veia dorsal do tarso.
- Encher a pipeta Pasteur com 1-2 mL de solução APBS + heparina.
- Insira o "agulha de vidro" na veia e começar a recolher o sangue lentamente por aspiração com a boca. É importante ter solução + APBS heparina na "agulha de vidro", pois isso vai impedir a coagulação do sangue e entupimento da ponta da agulha.
- 1-2 mL de sangue podem ser obtidas a partir de um sapo de tamanho médio.
- A pequena incisão na perna do sapo não precisa ser costurada ea ferida cicatriza em uma semana.
- Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante e lavar as células 1X com 10 mL de APBS frio.
- Sobreposição de 2 mL de sangue (1-5 x 10 6 células) em 1 mL de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) pré-aquecido em temperatura ambiente, a fim de separar os leucócitos do sangue a partir de células vermelhas do sangue.
- Centrifugar 20 min a 1.000 rpm em temperatura ambiente, sem freio, e depois recolher a banda de leucócitos.
- Lavar as células com 2X APBS por centrifugação a 1.400 rpm por 10 min a 4 ° C para remover o Ficoll residual.
- Neste ponto as células estão prontas para serem coradas com anticorpos para a análise de citometria de fluxo, ou para ser usado para ensaios em cultura in vitro.
8. Ensaio de Transplante de tumor
- Cerca de uma semana antes do degelo experimentar um novo lote de 15 / 0 células tumorais e certifique-se que as células começam a crescer também. Meio de cultura é descrito sucintamente na próxima seção e com mais detalhes em 3.
- Expandir as células 15 / 0 tumor.
- No dia do experimento, a contagem de células e determinar a morte celular por exclusão do azul Trypan. Morte celular deve ser inferior a 5%. Lave as células em 1X APBS frio, e centrifugar a 1.000 rpm a 4 ° C por 10 min.
- Ressuspender as células em meio de cultura tumor com uma densidade de 5 x 10 5 15 / 0 células por 300 ml.
- Transplante de 5 x 10 5 células em 300 mL de volume por rã por injeção subcutânea utilizando um calibre 25 08/05 agulha em um lado do lado (back) dorsal do animal.
- O crescimento do tumor vai começar dentro de 2-3 semanas após o desafio tumor. O aparecimento do tumor inicial deve ser observado e que o volume do tumor deve ser registrada a cada 2-3 dias. Volume tumoral (altura, comprimento X largura X) é medido com paquímetro.
- Uma vez que o tumor cresce a 3.500 mm 3 ou o sapo começa a olhar letárgico, ele precisa ser sacrificado para evitar desconforto.
9. Reagentes necessários:
- Anfíbios Tampão fosfato salino (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH para 7,5 utilizando NaOH 10N e filtro esterilizado 0,2 m através do filtro.
- Tricaina Sulfonato de Metano (TMS, MS-222) (Crescent Pesquisa Química CAS # 886-86-2).
- Bicarbonato de sódio (Fisher Scientific-S 233-500).
- Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL)
- Heparina sal de sódio (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
- Meio de cultura para Xenopus 15 / 0 tumores [ver 3 para mais detalhes]: 1 L de meio DMEM Iscove basal (Gibco-Invitrogen 11965) com 10 mL de insulina, 10 mL não-aminoácidos essenciais, 10 mL de penicilina-estreptomicina, 10 mg / mL de canamicina, 3 mL de primatone (Sheffield Divisão de Produtos), 1 mL de β2-mercaptoetanol, e 3,02 g NaHCO 3 em água (pH 7,0). Este meio é diluído para osmolaridade anfíbios, adicionando 30% de água bidestilada, e suplementada com 5% de soro fetal bovino, superantant 20% a partir de uma linha A6 Xenopus rim celular, e 0,25% do normal Xenopus soro.
10. Resultados representante
Figura 1. Análise estereoscópica de rejeição do enxerto de pele 12 dias pós-transplante. LG-6 sapo clonado recebeu um enxerto de pele de ambos (A) um MHC-idênticos LG-6 (não mostra rejeição) ou (B) um doador de MHC-díspares outbred (80% de rejeição). Setas mostra células pigmentadas iridophore prateado marcação saudável do tecido (não rejeitada) enxertados. (*) Marcos de não pinças, devido à rejeição.
Figura 2. Gp96 facilita a apresentação cruzada de antígenos de tumor em Xenopus. LG-15 PLs (5 x 10 5) foram pulsado de 1 hora no gelo ou com APBS (controle negativo), 1 mg de recombinante gp96 purificada a partir de um E. Cultura coli, ou 1 ou 0,5 mg de gp96 purificada a partir de 15 / 0 tecido tumoral. Após 3 lavagens, as células foram transferidos para destinatários adotivamente LG-15 para adultos (1 x 10 6 individual /). Três dias depois, ao vivo 15 / 0 células tumorais (5 x 10 5) foramtransplantado por injeção sc. Cada curva representa a cinética de crescimento do tumor em um sapo. Dias após o desafio, quando apareceu pela primeira vez tumores foram monitorados, eo tamanho do tumor foi determinada periodicamente com um (comprimento x largura x espessura) paquímetro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar potente Ag-específicos anti-minor H-Ag e anti-tumor respostas de células T 7. Este sistema modelo nos permite investigar as propriedades imunológicas gp96 durante o priming e fases de células efetoras.
Em relação à fase de priming, estudos iniciais destas respostas de imunização utilizado subcutâneo com gp96 purificada que exigia duas injeções de 10 mg gp96 em intervalos de duas semanas antes, em ensaios in vivo, tais como o enxerto de pele ou transplante tumor 2, 8. Em comparação, o método de apresentação cruzada que temos desenvolvido 7 e está usando atualmente é mais conveniente e eficiente. As múltiplas vantagens desta estratégia priming inclui o tempo e quantidade de proteína necessária para cada experimento. Por exemplo, a fim de imunizar um animal que leva quatro semanas e 20 mg de gp96, enquanto que com priming PL precisamos apenas três dias e 0,5 a 1 mg de proteína. Além disso, há menor variabilidade porque o priming consiste de apenas uma injecção de PLs pulsado com gp96. Esta é uma etapa crítica, pois se a agulha é retirada muito rapidamente durante uma das imunização por injeção sc, uma fração significativa de proteína podem ser perdidas, portanto, causando uma maior variabilidade individual. Importante, neste ensaio apresentação cruzada fornece uma maneira de investigar os mecanismos da gp96 mediada respostas imunes. Por exemplo, nós também podemos modular a expressão de certas moléculas como classe Ia na superfície de PLs antes pulsando com gp96 para investigar seu papel na gp96 respostas imune mediada por células T e priming. O processo de internalização gp96 também pode ser estudado por pré-incubação com anticorpos PLs ou concorrentes interferir com receptores endocítica 7.
Em relação à fase efetora, o modelo de Xenopus não só é adequado para caracterizar effectors célula imunológica in vitro por citometria de fluxo, matando e ensaios de proliferação 8, 9, mas também fornece poderosas em ensaios in vivo como a pele H-Ag-díspares menores enxertia e tumor ensaios de transplante. Ambos os ensaios estão bem estabelecidos no modelo de Xenopus no entanto, existem alguns passos essenciais que devem ser seguidas. Por exemplo, no ensaio de enxerto de pele atenção especial deve ser dada no manuseio do enxerto, especialmente quando o corte para fora da janela da pele do hospedeiro sobreposição. A janela tem que ser um pouco menor do que o enxerto de si para que o enxerto não vai cair. Além disso, durante o transplante tumor é importante primeiro injetar metade dos animais de controle seguido por aqueles experimental e de terminar com a segunda metade dos sapos de controle. Isso irá garantir que o tumor é viável durante o processo de injeção e produzirá dados mais consistentes. O fato de que este sistema se baseia em modelo de animais clonados ainda permite ampliar os estudos de células efetoras estimuladas por HSPs utilizando transferência de células adotivos 10.
Em resumo, os métodos apresentados aqui destacar o sapo Xenopus como um sistema modelo excepcional não-mamíferos para estudar HSPs como gp96 papel na vigilância imunológica e respostas imunes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
A criação de animais técnicos fornecidos pela Tina Martin e David Albright é apreciadas. Esta pesquisa foi suportada por concessões T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents needed: | |||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | |||
| NaCl, 1.15 g/L | |||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | |||
| KH2PO | |||
| 10N NaOH | |||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | |||
| Iscove DMEM basal medium | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Insulin | |||
| Non-essential amino acids | |||
| Penicillin-streptomycin | |||
| Kanamycin | |||
| Primatone | Sheffield Products Division | ||
| β2-mercapt–thanol | |||
| NaHCO3 | |||
| 30% double distilled water | |||
| 5% featal bovine serum | |||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | |||
| 0.25% of normal Xenopus serum | |||
| Materials and Equipment: | |||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | |||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD Biosciences | ||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | |||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon BD | ||
| Razor blades | |||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | ||
| 10 cm glass petri dishes | |||
| 9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR international | ||
| Tygon tubing | |||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | ||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Helios calipers | |||
| Dissecting microscope | |||
| High intensity illuminator | |||
| Hemacytometer | |||
| Un-bunsen burner | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u, L, Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u, L, Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
