Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)

Published: August 2, 2010 doi: 10.3791/2027
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Waterloo

Summary

DNA - النظائر مستقرة تحقق هو أسلوب زراعة مستقل لتحديد وتوصيف المجتمعات النشطة من الكائنات الحية الدقيقة التي هي قادرة على الاستفادة من ركائز محددة. استيعاب الركيزة المخصب في النظائر الثقيلة يؤدي إلى دمج ذرات المسمى في الكتلة الحيوية الميكروبية. الكثافة تنبيذ فائق التدرج يسترد الحمض النووي المسمى لتحاليل جزيئية المصب.

Abstract

DNA - النظائر مستقرة تحقق (DNA - SIP) هو أسلوب قوي للتعرف على الميكروبات النشطة التي ركائز استيعاب الكربون والمواد الغذائية ولا سيما في الكتلة الخلوية. على هذا النحو ، وقد تم زراعة هذه التقنية المستقلة منهجية هامة لإسناد وظيفة التمثيل الغذائي للمجتمعات التي تسكن مجموعة متنوعة واسعة من البيئات البرية والمائية. بعد حضانة عينة بيئية مستقرة ، مع النظائر المركبات المسمى ، يخضع لاستخراج الحمض النووي تنبيذ فائق التدرج الكثافة واللاحقة تجزيء متدرجة لفصل الأحماض النووية للكثافات مختلفة. باسترداد المسمى تنقية الحمض النووي من كلوريد السيزيوم ولا تحمل علامات الحمض النووي لالتوصيف الجزيئي لاحقة (مثل بصمات الأصابع ، ميكروأرس والمكتبات استنساخ ، metagenomics). إن الرب الفيديو هذا البروتوكول يوفر البصرية خطوة بخطوة تفسيرات للبروتوكول للتجزيء الكثافة تنبيذ فائق التدرج التدرج ، والانتعاش من الحمض النووي المسمى. البروتوكول يتضمن أيضا نموذج بيانات المسبار ويسلط الضوء على النصائح الهامة ويحذر التي يجب مراعاتها لضمان نجاح المسبار الحمض النووي التحليل.

Protocol

1. إعداد الكواشف

DNA - SIP يتطلب استخدام الكواشف التي ينبغي أن تكون معدة مسبقا من الإجراء الفعلي. يتم سرد كل الاتجاهات لإعداد كاشف في هذا القسم ويتم تعديلها من بروتوكول SIP السابق 1.

  1. السيزيوم كلوريد (CSCL) حل لإعداد التدرجات SIP -- إعداد حل 7،163 CSCL M تدريجيا عن طريق تذويب 603،0 غراما من CSCL في الماء المقطر منزوع الأيونات و(DDH 2 O) إلى الحجم النهائي من 500 مل. كن حذرا لا تتجاوز 500 مل! والاحترار الحل قليلا مع التحريك يساعد على إذابة جميع CSCL. قسامة الحل النهائي في aliquots مختومة. في المختبر ، وهي ممارسة شائعة لتخزين إعداد 100 مل aliquots في 125 مل قارورة المصل ، والتي هي ثم تجعيد مختومة مع سدادات المطاط بوتيل. ويمكن تخزين aliquots مختومة إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية). الاختام تساعد على منع التبخر وCSCL "قشرة" التشكيل. تحديد كثافة المحلول قبل ثلاث نسخ وزنها 100 ميكرولتر aliquots ، أو باستخدام مقياس الإنكسار الرقمية (مثل رايشرت AR200) ​​التي تم معايرتها بعناية لحلول CSCL. معايرة مرة واحدة بنجاح ، AR200 رايشرت ثابت ويقدم قراءات دقيقة لعدة سنوات. في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) ، والكثافة النهائية لهذا الحل عادة ما يتراوح 1،88-1،89 -1 مل ز. الكثافة يختلف قليلا في كل مرة يتم إعداد الأوراق المالية الجديدة.
  2. محلول كلوريد السيزيوم لإعداد التدرجات مع بروميد إيثيديوم (EtBr) -- ضم 250 غرام من CSCL مع 250 مل من الماء المعقم DDH O 2. قسامة هذا الحل في قارورة المصل منفصلة التي تم تجعيد مختومة بأختام بوتيل المطاط كما هو موضح في 1.1.
  3. التدرج العازلة -- ضم 50 مل من 1 M - تريس حمض الهيدروكلوريك ، 3.75 بوكل ز و 1 مل من EDTA M 0،5-400 مليلتر من الماء. حل بوكل ، ثم تضاف DDH 2 O إلى 500 مل. فلتر تعقيم وتعقيم. الحل النهائي هو 0.1 م تريس ، 0.1 و 1 بوكل M EDTA ملم.
  4. البولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل -- إعداد حل الربط عن طريق تذويب 150 غ من مادة البولي ايثيلين جلايكول 6000 و 46.8 غرام من كلوريد الصوديوم في المياه المعقمة DDH O 2 لإجمالي حجم 500 (PEG 30 ٪ ، 1.6 M كلوريد الصوديوم) مل. الأوتوكلاف.
    ملاحظة : هذا الحل إلى مرحلتين يفصل مع التعقيم. وتشمل بقضيب في زجاجة تعقيمها بحيث يمكن أن تكون الحل مختلطة بشكل صحيح عند حدوث ذلك.
  5. TE العازلة -- تحضير محلول من 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) و 1 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) في المياه المعقمة DDH O 2 ، وذلك باستخدام حلول الأسهم تعقيمها من 1 EDTA M - M تريس حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) و 0.5 ( 8.0 درجة الحموضة). تصفية وتعقيم الأوتوكلاف.
  6. الايثانول 70 ٪ -- الجمع بين 350 مل من الايثانول عالية النقاء مع 150 مل من الماء المعقم DDH O 2.

2. حاضنات العينة واستخراج الحمض النووي

الحمض النووي للSIP حضانات ، وحضنت العينات عادة مع نظائر الكربون الثقيل (13 C) الركيزة. وفترات الحضانة وشروط (مثل المواد الغذائية التكميلية ، والرطوبة ، الضوء) تختلف تبعا لنوع العينة التي حضنت وطبيعة الركيزة. وقد الحمض النووي SIP تجارب أجريت بنجاح باستخدام مجموعة متنوعة من مركبات الكربون واحدة 2،3 متعددة مركبات الكربون 4،5،6 ، وباستخدام النيتروجين أو الأكسجين المسمى 7،8 9. ومع ذلك ، فإن العائق إلى استخدام 15 أو 18 N - O - مركبات المسمى هو فصل انخفض المادية للحامض النووي المسمى ، ويرجع ذلك أساسا إلى وجود عدد أقل من ذرات النيتروجين والأكسجين في الحمض النووي الريبي وبالنسبة لذرات الكربون.

A المراقبة الحرجة لتجارب الحمض النووي SIP هو الحضانة المنشأة متطابقة مع الركيزة (على سبيل المثال 12 C) الأم. هذا الاحتضان يوفر المقارنة اللاحقة للتأكد من أن أي وضع العلامات واضحة للحمض النووي ليست قطعة أثرية من تنبيذ فائق أو اختلافات المحتوى G C + كثافة الحمض النووي في المساهمة في الفصل 10. من المهم أيضا للحفاظ على المواد المجمدة عينة للمقارنة "خفيف" و "الثقيلة" الحمض النووي ، وقيمتها بما في ذلك السيطرة عدم الركيزة لتقييم التغيرات السكانية في جميع أنحاء خلفية حضانة SIP.

  1. احتضان العينات البيئية في عوالم مصغرة تحتوي الركيزة المسمى (الشكل 1). في تجربتنا ، وجدنا أن الحد الأدنى للإدماج بين 500-500 μmol من الكربون C 13 جرام من العينة وسوف تكون مناسبة للعينات التي تحتوي على الكتلة الحيوية العالية مثل عينات التربة 1. للعينات المائية التي تحتوي على أقل من الكتلة الحيوية التربة ، قد أدرجت 100-100 μmol من الكربون 13 C للتر الواحد تسفر عن كشف النظائر الثقيلة التوقيع 1. كمية الكربون التعديل ، سوف نسبة الكربون في الكتلة الحيوية وأدرجت شرط إضافة المغذيات التكميلية لاستيعاب جميعها تعتمد على خصائص العينات التي تم تحليلها واستهدفت سrganisms المصالح. وهناك مجموعة واحدة من المبادئ التوجيهية حضانة العينة لا تكون قابلة للتطبيق بالنسبة لجميع العينات. الأهم من ذلك ، ينبغي تركيز الركيزة المستخدمة في الحضانة SIP يكون مثاليا أقرب وقت ممكن لتركيز واجه عادة في الموقع ؛ التحيز التجريبية قد يكون نتيجة لظروف ثقافة تخصيب 10.
  2. بعد حضانة مع عينة ركيزة مستقرة - النظائر المسمى ، واستخراج الحمض النووي من عوالم مصغرة باستخدام بروتوكول استخراج الدقيق (PCR أو صغيرة لادخال الاستنساخ) أو انحلال موثوق الأنزيمية للاستنساخ الوزن الجزيئي عالية (مثل إدراج metagenomics واسعة). شارك في استخراج الحمض النووي الريبي لا يؤثر عموما التحليل ، لذلك يمكن استخدام البروتوكولات التي تسفر RNA وكذلك الحمض النووي. سوف تنبيذ فائق من الحمض النووي المستخرج لا القص شظايا أقصر من أزواج كيلوبايت ~ 50 1.
  3. تحديد الحمض النووي المستخرج قبل الإعداد للأنابيب تنبيذ فائق التدرج CSCL. تحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (مثل Nanodrop 2000) إذا كان البروتوكول استخراج الحمض النووي غلة فقط (مثال : العمود القائم على مجموعات). بدلا من ذلك ، كميا باستخدام agarose هلام الكهربائي.

3. إعداد حلول متدرجة لتنبيذ فائق

ويشمل هذا الإجراء بإضافة الحمض النووي لأنابيب نابذة فائقة السرعة. هناك أكثر من نوع واحد من الأنابيب والدوار حتى الدقيقة البروتوكول سوف تختلف وسوف تعتمد على تعليمات الشركة المصنعة. قالت فيه ان نوصي استخدام الدوار العمودي جيدا لضمان أقصى قدر ممكن من فصل الحمض النووي الخفيفة والثقيلة. نستخدم بيكمان كولتر VTI - 65.2 الدوار مع 16 بئرا لعقد Polyallomer QuickSeal 5.1 مل أنابيب والبروتوكول سيوفر خطوات واعتبارات لهذه الشروط.

  1. باستخدام تركيزات الحمض النووي تحديدها في الخطوة 2.3 ، حساب حجم استخراج الحمض النووي المطلوب من ما هو مطلوب لتوفير 0.5 ميكروغرام -- 5 ميكروغرام من الحمض النووي في أنابيب نابذة فائقة السرعة.
  2. الجمع بين الحمض النووي المستخرج (0.5 -- 5 ميكروغرام) مع مخزن التدرج (راجع الخطوة 1.3) و 4.8 مل من CSCL M 7،163 إلى إجمالي حجم مل 6 ~ في أنبوب 15 مل القابل للتصرف العقيمة. علما بأن كثافة المحلول CSCL يمكن أن تختلف حتى في نفس molarity (انظر الخطوة 1.1). ويمكن استخدام المعادلة التالية لتحديد حجم الاحتياطي من خليط / DNA التدرج المطلوب لتوليد نسبة الخلط المناسبة :

    وأضاف X حجم محلول المخزون CSCL X 1.52 -- حجم الانحدار حل العازلة والحمض النووي (مل) = (الكثافة النهائية المرجوة CSCL كثافة محلول المخزون)

    تحديد حجم المخزون حل CSCL في 4.80 مل. ينبغي أن تكون الكثافة النهائية المرجوة 1.725 مل ز -1. تم تحديد كثافة محلول المخزون في الخطوة 1.1.

    نلاحظ أيضا أن كميات النسبية للCSCL والتدرج العازلة / الحمض النووي سيؤدي إلى زيادة حجم مجتمعة من 5.1 مل. وتستعد وحدات التخزين أكبر من حجم القدرة القصوى للأنابيب نابذة فائقة السرعة (أكثر من 5.1 مل) ضمان عدم وجود حل ما يكفي لملء الأنبوب تماما.
  3. مزيج من قبل 10 مرات عكس. الحمض النووي هو مستقر في درجة حرارة الغرفة في CSCL.

4. إنشاء التدرج EtBr التحكم (اختياري)

لأن EtBr هو صبغ الإقحام أن المجمعات مع الحمض النووي مما يجعلها مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، والتدرجات التحكم التي تحتوي على EtBr هي مفيدة لأنها توفر تأكيد فوري للتشكيل البصري قبل التدرج تجزيء عينة من أنابيب (مثل الشكل 1). إدراج أنبوب التحكم التي تحتوي على EtBr وخليط من كل من DNA - C 12 و 13 من طراز C - DNA (أو 14 N - DNA و 15 N - DNA) تتيح لرؤية الفوري لتشكيل الفرقة داخل الأنابيب عند الانتهاء من تنبيذ فائق. هذا مهم لأن وجود تمزق الأنبوب خلال تنبيذ فائق أو ظروف تشغيل مبرمجة بشكل غير صحيح يمكن أن يؤدي إلى فشل في تكوين التدرج. منضمة إلى الحمض النووي ، ويقلل من كثافة EtBr من الحمض النووي ونتيجة لذلك ، يتبع بروتوكول مختلفة لإعداد التدرجات. علما أنه يمكن استخدام غيرها من البقع الحمض النووي بدلا من 11 EtBr لكن البروتوكول يتطلب التحسين مع fluorophores الأخرى.

  1. التدرج المكافحة تتطلب مجلدين من الحمض النووي الجيني : واحد يسمى كاملا مع النظائر مستقرة واحد من دون تسمية. نستخدم عادة إما Sinorhizobium meliloti مثقف في وسائل الإعلام التي تحتوي على 13 أو 12 C - C - الجلوكوز كمصدر وحيد للكربون ، أو سلالة الحمام Methylococcus الممحفظة مثقف في وجود 13 أو 12 C - C - الميثان وضوابط لدينا.
  2. الجمع بين 5 -10 ميكروغرام كمية من كلا من C - 12 و 13 الحمض النووي DNA مع C - الاحتياطي التدرج إلى الحجم النهائي من 1.00 مل في أنبوب المتاح المسمار الحد الأقصى 15 مل.
  3. إضافة 1،00 غرام من CSCL الصلبة في أنبوب واحد. مزيج بواسطة انقلاب.
  4. إضافة 110 ميكرولترمن 10 مجم مل حل EtBr -1 و 4.3 مل من محلول 1 ز -1 مل CSCL الأسهم إلى الحد الأقصى للأنبوب المسمار نفسها المستخدمة في الخطوة 4.2. فإن الكثافة النهائية من الحل التقريبي الذي من الحل الأسهم CSCL الأصلي.
  5. وأيضا "على بياض" حل إضافية تتضمن السيطرة EtBr تكون هناك حاجة لموازنة حل بإنشائه في الخطوة 4.4. الجمع بين 1.00 مل من الاحتياطي متدرجة ، 1،00 غرام من CSCL ، 110 ميكرولتر من 10 ملغ مل حل EtBr -1 و 4.3 مل من محلول 1 ز -1 مل الأسهم CSCL منفصلة في أنبوب 15 مل المسمار الحد الأقصى وتخلط بواسطة انقلاب.

5. تنبيذ فائق

  1. استخدام لمبة وماصة باستور ، وملء بعناية أنابيب نابذة فائقة السرعة مع حلول متدرجة أعد في خطوة 3.2 (4.4 أو الخطوات إذا إعداد التدرج السيطرة EtBr). إضافة بعناية حلول للأنابيب باستخدام ماصة باستور. تسمية أنابيب على الكتف أنبوب مع علامة دائمة الغرامة. تنبيه : تأكد من أن يتم تعبئة أنابيب تماما مع قاعدة العنق الأنبوب. أنابيب مليئة كاف من المحتمل أن تنفجر خلال تنبيذ فائق.
  2. عندما يتم شغل كل من أنابيب المطلوبة مع حلول العينة ، سجل الشامل الدقيق لكل أنبوب. أنابيب الزوج والتوازن لهم داخل 00-10 ملغ. للموازنة ، والعثور على أزواج متماثلة تقريبا ، وإضافة أو إزالة كميات دقيقة حتى يتم حل متوازن ، والحفاظ على مستوى حل أقرب إلى قاعدة رقاب أنبوب ممكن. علما بأن لوزن الأنابيب ، ونحن نستخدم مقلوب 15 مل المسمار غطاء الأنبوب الذي تم قطع نصف حامل أنبوب للتوازن.
  3. ختم الأنابيب باستخدام "أنبوب ممتاز" وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. تأكد من أن يتم ختم الأنابيب بشكل صحيح عن طريق عكس الضغط عليهم ومعتدلة. وزن الأنابيب مرة أخرى للتأكد من أنها لا تزال قادرة على تحقيق التوازن بعد تسرب الى داخل 00-10 ملغ.
  5. التحقق من كل جانب الدوار بعناية للتأكد من أن الآبار نظيفة وخالية من الحطام أو الغبار الذي قد ثقب الأنابيب أثناء تنبيذ فائق.
  6. إدراج هذه الانابيب بداخل الدوار مع أزواج متوازنة عكس بعضها البعض. سجل موقع الدوار من كل عينة لأن عملية تنبيذ فائق يمكن أن يؤدي إلى تلف أو تسميات علامة تمحى. ختم بعناية الآبار الدوار كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
  7. تحميل الدوار في نابذة فائقة السرعة. إغلاق الباب نابذة فائقة السرعة وتطبيق فراغ. إذا باستخدام 65.2 VTI الدوار ، تعيين سرعة دوران إلى 44100 دورة في الدقيقة (~ 177000 XG AV) ، ودرجة الحرارة عند 20 درجة مئوية ، وتنبيذ فائق الوقت ل36-40 ساعة. حدد فراغ ، والتسارع الأقصى ، وإيقاف الفرامل (لا يضمن التدرج تعطلت بسبب التباطؤ). علما أن إيقاف الفرامل سيضيف مبلغا إضافيا إلى 1-2 ساعات وقت التشغيل. نلاحظ أيضا أن أقصر الأوقات تشغيل قد لا تحقق ما يكفي من قرار الفرقة. ينصح يدير تنبيذ فائق طويلة ، لأنها تؤدي إلى مزيد من قرار متميزة العصابات الحمض النووي.
  8. فور الانتهاء من إجراء تنبيذ فائق ، إزالة الدوار بعناية. تجنب أي إمالة أو الاهتزاز من الدوار ، وإزالة أنابيب بلطف من الدوار لتجنب تعكير التدرجات داخل الأنابيب. في الحالات النادرة ، وسوف تنفجر خلال أنبوب للتشغيل. إذا كان الأمر كذلك ، فإن هناك فرصة أن التدرجات في أنابيب أخرى لا تشكل بشكل صحيح. إذا تم تضمين الانحدار السيطرة ، والتحقق من هذا الأنبوب بعناية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتأكيد تشكيل التدرج. إذا لم تدرج بشكل صحيح في شكل أنبوب السيطرة ، فمن الأفضل أن نكرر كل خطوة 5. لاحظ أنه قد يتم تخزين أنبوب EtBr تحكم سيطرتها وفارغة في الظلام وإعادة استخدامها لمدة تصل إلى ستة أشهر. الحرص على تنظيف الدوار بعناية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مرة واحدة تمت إزالة أنبوب تنفجر. لا تستخدم فرشاة معدنية أو عمال النظافة لتنظيف الآبار جلخ الدوار من أجل تجنب الخدوش على الآبار الدوار! ويمكن شراء الدوار محددة الفرش ومحلول التنظيف من بيكمان.

6. التدرج تقطير

هناك نوعان من الأساليب التي تستخدم حاليا لاستعادة الحمض النووي من الأنابيب نابذة فائقة السرعة : تجزئة واستخراج الإبرة. ووصف هذا البروتوكول فقط عملية استخراج الحمض النووي باستخدام تقنية تجزيء. وذلك لأن معظم لتجارب SIP ، الحمض النووي المسمى لا يمكن تصور مع EtBr ويجب بدلا من ذلك يتم الكشف عن طريق مقارنة الكسور الخفيفة والثقيلة ما يعادلها من أنابيب العينات متعددة. ينصح بشدة مضخة محقنة لاسترداد كسور متساوية التدرج الكثافة من أنابيب نابذة فائقة السرعة. نستخدم نموذج BSP مضخة التسريب (برينتري العلمية المحدودة). ويمكن أيضا مضخة منخفضة تدفق تمعجية أو مضخة HPLC استخدامها.

  1. ملء 60 مل العقيمة المحاقن المعقمة مع DDH 2 O تحتوي على ما يكفي من صبغة زرقاء bromophenol لتوفير اللون الأزرق الداكن. مكان الحقنة على ذراع التحميل في ضخ حقنة. نعلق أنبوب مضخة مزودة إبرة عيار 23 "(1) وتشغيل المضخة حتى بعض DDH 2 O قد حان حتى نهاية مذكرة الإبرة. أن أي فقاعات هواء في هذا العرض DDH O 2 سوف تؤثر سلبا على عملية التجزيء.
  2. الإصلاح واحد من أنابيب تنبيذ فائق الى وقفة المشبك. تأكد من أن المشبك ضيق بما فيه الكفاية لمنع أنبوب من النازحين ولكن لا يجري مثل هذا الضغط على الانبوب سيؤدي الافراج عن حل CSCL عندما اخترقت الأنبوب. ثقب في أسفل جدا من الأنبوب على طول خط التماس أنبوب باستخدام مقياس الطازجة 23 1 "إبرة. للحصول على أفضل النتائج ، يخترق الأنبوب في الطريقة التي تسيطر عليها ، وسريعة ، وثقة ، وهذا من الصعب جدا القيام بعمل جيد ، وممارسة عدة مرات قبل وحاولت في البداية مع هذا أنابيب العينات.
  3. لكل عينة ، وإعداد 12 العقيمة microcentrifuge 1.5 مل أنابيب مع تسميات تشير إلى عدد العينات ونسبة (1-12 ؛ الثقيلة للضوء). باستخدام إبرة تعلق على أنابيب ضخ (الخطوة 6.1) ، يخترق الجزء العلوي من أنبوب على أنبوب الكتف العلوي ، على طول خط التماس. جمع حل التدرج باستخدام أنابيب microcentrifuge. كما أجريت لأسفل الأنبوب ، يخترق الأنبوب بطريقة سريعة والسيطرة عليها. الممارسة مسبقا ونكون حذرين للغاية لاستخدام تسيطر عليها حركة سحب للحيلولة دون تمرير إبرة القسري من خلال أنبوب والى الاصبع! معدل استخدام مضخة معايرة في وقت سابق ان تسفر 12 × 425 ميكرولتر كسور في 12 دقيقة (425 دقيقة ميكرولتر -1).
  4. استخدام الإنكسار الرقمية (مثل رايشرت AR200 ؛ مستحسن) أو وجود رصيد التحليلية لفحص كثافة من كسور التدرج السليم لتأكيد تشكيل التدرج. وسوف تحتاج إلى استخدام ~ 50 ميكرولتر من العينة لهذا الاختبار. نحن غالبا ما تشمل الحمض النووي محض الثقافة في أنبوب واحد (كما هو موضح لإعداد التدرجات السيطرة EtBr) ليكون بمثابة الرقابة على تجزيء واستخدام ذلك لتحديد الكثافة. ويتوقع أن تتراوح كثافة من ~ 1،690-1،760 -1 مل غرام ، مع كثافة وسيطة من ~ 1.725 مل ز -1.

7. الحمض النووي الأمطار

  1. الحمض النووي يعجل من جميع الكسور بإضافة أول 20 ميكروغرام من بولي أكريلاميد خطية كحامل لهطول الأمطار. مزيج بواسطة انقلاب. إضافة 2 مجلدات من حل PEG (راجع الخطوة 1) وتخلط بواسطة انقلاب. وينبغي أن تستخدم لاحظ أن حاملة لهطول الأمطار (مثل الجليكوجين أو بولي أكريلاميد الخطي) هو أمر حاسم لاستعادة كمية من الحمض النووي من الفصائل الانحدار ، ولكن الحذر إذا تم استخدام الجليكوجين كحامل لهطول الأمطار لهذا البروتوكول. وقد تبين أن التحضيرات لالجليكوجين تكون ملوثة الحمض النووي والتلوث الجرثومي يمكن بسهولة الخلط بين التفسير الكسور التدرج SIP 12.
  2. ترك أنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة للسماح لترسيب الحمض النووي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن ترك أنابيب بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  3. ز الطرد المركزي في 13000 لمدة 30 دقيقة مع الجزء الخلفي من الأنابيب التي تواجه الخارج عن اتجاه ثابت في الأنبوب الدوار. نضح بعناية وتجاهل طاف. وينبغي أن يكون بيليه تكون مرئية ولكن يمكن أن يكون من الصعب جدا أن نرى في هذه المرحلة. العمل تحت مصدر الضوء الساطع (مثل مصباح مكتبي) للمساعدة في وضع الرؤية وبيليه.
  4. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70 ٪. ز الطرد المركزي في 13000 لمدة 10 دقيقة. نضح بعناية وتجاهل طاف. سيكون بيليه وعادة ما تكون أكثر وضوحا لهذه الخطوة ، ولكن سوف تنأى عن جدار الأنبوب بسهولة أكبر.
  5. السماح لبيليه لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. تعليق كل بيليه في 50 ميكرولتر من العازلة TE (انظر الخطوة 1.5). تشغيل 5 ميكرولتر من كل جزء على agarose هلام وفقا لبروتوكولات المختبر القياسية.

8. جزء توصيف

والطريقة المستخدمة لتوصيف الكسور التدرج لتقييم نجاح أي حضانة SIP تختلف تبعا لتوافر المختبرات والمعدات. باستخدام طريقة أخذ البصمات لاستهداف الجينات 16S الرنا الريباسي هو النهج والأساليب المشتركة مثل تقييد تعدد الأشكال المحطة جزء طول (T - RFLP) ، أو تغيير طبيعة التدرج الكهربائي للهلام (DGGE) مناسبة (الشكل 1). بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، نتوقع أن تكون مرتبطة الحمض النووي الضوء لتكون مرتبطة مع الكسور 9-11 (~ 1،705-1،720 مل ز -1) وبصمات الحمض النووي داخل الكسور الثقيلة 5-8 (~ 1،720-1،735 مل ز -1 ). بصمات فريدة المرتبطة الكسور 5-8 من النظائر مستقرة ، حضنت العينات ، ولكن ليس مع السكان الأصليين ، الركيزة ضوابط المحتضنة يقدم أدلة قوية تربط بين الكائنات الحية محددة مع استقلاب الركيزة المسمى معين. وإن كانت غير كافية الحمض النووي المسمى يبقى لبعض التطبيقات (التهجين ، metagenomics) ، قد يتم استخدام عدة التضخيم التشريد لإنتاج كميات أكبر 13-15 ولكن هذا الوهم يمكن إدخال الحمض النووي في تضخيم 14،16.

"jove_title"> 9. النتائج

سوف نموذجية الحمض النووي SIP النتائج تبرهن على فصل الحامض النووي لا تحمل علامات وصفت في الانحدار التي شكلتها تنبيذ فائق. مثالي ، لن يتحقق حل كامل للمواد عالية الوزن الجزيئي وراثية (مثل C 13 ، 15 N) من مواد لا تحمل علامات. يمكن شهد القرار بصريا من خلال مراقبة تشكيل الفرقة في أنابيب EtBr السيطرة. ويمكن أيضا أن تركيزات من الحمض النووي الجينومي استرجاع الواردة في الكسور التدرج الفردية يمكن استخدامها لتأكيد السليم تشكيل التدرج.

لهذا البروتوكول ، ونحن وتشمل النتائج ممثل تنبيذ فائق التدرج تنفيذها باستخدام الحمض النووي من ثقافتين النقي (الشكل 2). التدرج مجزأة تضمين هنا أعدت باستخدام الحمض النووي المستخرج من الجينومية س. meliloti (ATCC 1021) ، و 13 C - المسمى م. الممحفظة شارع. الحمام. تنبيذ فائق التالية ، تجزيء والحمض النووي الانتعاش ، والمسمى لا تحمل علامات الحمض النووي الجيني منفصلة في أجزاء منها مع التدرج كثافات مختلفة (الشكل 2A). ويمكن ملاحظة النظائر الثقيلة في الحمض النووي المسمى الكسور 4-5 ، في حين تم العثور على الحامض النووي لا تحمل علامات بتركيزات عالية في الكسور 9-10. اتسمت الحمض النووي من كل جزء مع تغيير طبيعة التدرج الكهربائي للهلام (17) ومنتجات PCR - تضخيم المتولدة المنفصلة الأنماط المقابلة لربط الكائنات المشمولتين في الانحدار (الشكل 2B). وتراوح كثافة من كسور ~ 1،580-1،759 مل ز -1 ، وتظهر أنهم من أجل تقليل كثافة من اليسار إلى اليمين.

على الرغم من أن الفصل 13 نقية و 12 C - C - الحمض النووي يمكن أن تكون وضوحا (الشكل 2) ، قد حضانات عينة بيئية يكون من الصعب تفسيرها. على سبيل المثال ، فإننا المحتضنة التندرا التربة من خليج حازمة (نونافوت ، كندا) إما مع الجلوكوز C - C - 12 المسمى أو 13 لمدة 14 يوما حتى 15 درجة مئوية. أظهرت المواد الهلامية agarose أيرزمري التدرج الحمض النووي التي تم كسر 'طخت" الحمض النووي الجيني عبر كسور 70-10 لكلا 12 و 13 من طراز C - C - حضانات (الشكل 3A و3C ، على التوالي). في هذه الحالة ، لا يمكن إلا 13 C - تخصيب الكتلة الحيوية من الأنواع الجرثومية معينة يتم تحديدها مع نهج مثل DGGE الجينات الرنا الريباسي 16S. 12 C - DNA الجلوكوز التربة المحتضنة يولد أنماط متشابهة في جميع أجزاء الانحدار (الشكل 3B) ، ولكن C - 13 عينة الجلوكوز المحتضنة ولدت بصمات DGGE التي ترتبط بشكل فريد مع الكسور 5-8 (الشكل 3D). ذات أهمية خاصة هي عصابات الحفظ المشار إليها بواسطة الأسهم. هذا المهيمنة 'phylotype' متناسقة عبر جميع أجزاء متدرجة ولكن التحولات في الحمض النووي لأثقل الكسور التي تم الحصول عليها من التربة C - 13 المحتضنة الجلوكوز. والحمض النووي لاحقة تتابع هذه الفرقة و / أو استنساخ التحليل مكتبة التأكد من هوية هذا الجين وبخاصة الرنا الريباسي 16S دليل metagenomic لاحقة أو زراعة المستندة إلى النهج.

الشكل 1
الشكل 1. الخطوط العريضة للتجربة الحمض النووي SIP تشمل عينة الحضانة ، واستخراج الحمض النووي ، CSCL تنبيذ فائق التدرج الكثافة وتوصيف الحمض النووي مع التقنيات الجزيئية.

الشكل 2
الشكل 2. النتائج المتوقعة لتجزيء التدرج SIP بما في ذلك الحمض النووي من ثقافتين النقي. (أ) تم تشغيل Aliquots من الحمض النووي من الكسور الانحدار 1-12 على agarose هلام 1 ٪ من الانحدار التي تحتوي على 13 C - المسمى م. الممحفظة حمام سلالة (الكسور 4-6) و 12 C - المسمى س. meliloti (الكسور 8-10). يتم تضمين سلم 1 - KB للمقارنة (B) PCR - تضخيم الحمض النووي من نفس الكسور وتعمل على جل DGGE 10 ٪. أنماط البصمات تكشف اختلافات واضحة بين 5 و 9 كسور ، على سبيل المثال.

الشكل 3
الشكل 3. النتائج المتوقعة لfractionations التدرج SIP من حضانات عينة التربة. وAliquots الكسور التدرج من كل من التربة C - 12 المعدلة الجلوكوز (A) و 13 C - الجلوكوز التربة المعدلة (C) تعمل على 1 ٪ agarose المواد الهلامية ويضم سلم 1 - KB للمقارنة. وتظهر بصمات DGGE المقابلة لكل من هذه العينات في الفقرة (ب) و (D) أخذ البصمات من الكسور يكشف تخصيب الأصناف البكتيرية سيما في عينة C - 13 المعدلة الجلوكوز في الكسور 5-8 (D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصميم السليم للنظائر مستقرة ، يحقق التجارب ذات أهمية حاسمة للحصول على الحمض النووي المسمى أعلاه المجتمع الخلفية لا تحمل علامات. وقد نوقشت الاعتبارات المتصلة عينة مرات الحضانة ، وتركيزات الركيزة ، وشروط الحضانة (المواد الغذائية على سبيل المثال ، رطوبة التربة) ، عبر الرضاعة وتكرارها في مكان آخر ونحن نوصي 10،18 القارئ الرجوع إلى هذه المنشورات عند تصميم حضانة SIP. يتعلق بالبروتوكول الحالي ، فإن الأمر يستحق التعليق على اعتبارات إضافية تتعلق بتفسير البيانات من التدرجات SIP. نظرا لطبيعة عملية تنبيذ فائق ، بالإضافة إلى أنه من المهم أن تشمل هذه الضوابط والثقافات الأصلية ، نقية والركيزة حضنت العينات للتأكد من أن العصابات التي تظهر أو تختفي في أجزاء معينة هي ليست من التحف البروتوكول نفسه. على سبيل المثال ، قد دنا ضمن التدرج نابذة فائقة السرعة لا تكون مرئية في agarose هلام (الشكل 2A) ، ولكن قد لا يزال يلوث كامل طول الانحدار (الشكل 2B). على الرغم م وكان أنماط الممحفظة هي الأكثر متميزة في الكسور الكثيفة (5-7) من الجل هو مبين في الشكل 2B ، لاحظ لا يزال نمط DGGE نفسه في أخف الكسر (12). مع وجود ضوابط مدروسة بعناية ، وتفسير البيانات SIP جزء التدرج هو ممكن.

نظرا لطبيعة بعض التجارب SIP مصممة تصميما جيدا (على سبيل المثال القريب في تركيزات الركيزة الموقع ، وأوقات حضانة قصيرة) ، يمكن إدماج النظائر تكون منخفضة للغاية 10. بالإضافة إلى ذلك ، معظم الكائنات الحية الدقيقة في البيئات الأرضية أو المائية وتوليد مرات بالمقارنة مع نمو طويلة في المختبر ، وتتطلب مرات الحضانة الطويلة للوصول إلى مستويات يمكن كشفها لتخصيب النظائر. فئات أخرى قد تكون قادرة على تأييض مجموعة متنوعة من ركائز ، ويمكن أن تنمو بشكل كامل على الركيزة المسمى. هناك أيضا مجتمعات (مثل المياه الجوفية) التي قد تترافق مع انخفاض مستويات الكتلة الحيوية ، وتوليد العائدات المنخفضة من الحمض النووي المستخرج. في جميع هذه الحالات ، قد استرجاع كمية من الأحماض النووية المسمى أن يكون تحديا.

للتحايل على هذه القيود ، ومجموعة متنوعة من الجزيئات الحاملة الطبيعية والاصطناعية موجودة والتي تساعد في هطول الأمطار والانتعاش من الحمض النووي من التدرجات CSCL. يمكن أن تكون حاملة جزيئات بيولوجية في الأصل مثل الجليكوجين أو الحمض النووي من كائن حي archaeal 19 سنة ، أو الاصطناعية في الطبيعة ، مثل بولي أكريلاميد الخطية. الفائدة من استخدام الجزيئات الحاملة مثل هذه عند تنفيذ الحمض النووي SIP هو أنها يمكن أن تتيح تصور العصابات في التدرجات CSCL التي لن تكون عادة واضحة وضمان استرداد كمية من الحمض النووي تركيزات منخفضة. الإنعاش ناجحة كميات منخفضة من الحمض النووي نانوغرام من التدرجات CSCL يتطلب فعلا استخدام جزيء الناقل 1،12. وقد أشارت الأبحاث الحديثة التي يمكن في كثير من الأحيان الجزيئات الناقلة تم الحصول عليها من مصادر بيولوجية تكون ملوثة من الحمض النووي للكائن المصدر (12) والنتائج هي من الصعب جدا التمييز بينها وبين الأنماط المرتبطة الحمض النووي المسمى C - 13 (لا تظهر البيانات). لذا فمن المستحسن أن يتم استخدام الجزيئات الحاملة الاصطناعية مثل بولي أكريلاميد الخطية لالدنا SIP. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام متعددة التشريد التضخيم (MDA) توليد عوائد عالية الدقة من الحمض النووي المسمى لتحاليل جزيئية 13،14 المصب ، على الرغم من الوهم قد تتولد من التضخيم والتحليلات الجزيئية المكتشفة في اتجاه مجرى النهر 14.

واحد من التطبيقات أقوى من الحمض النووي SIP التي لم يتم استغلالها بالكامل والانتعاش المحتملة من الحمض النووي من أفراد المجتمع نشطة للتحليل metagenomic المكتبة. نتوقع أن تقدم كبير في اكتشاف انزيم ستنجم عن اندماج نظائر مستقرة تحقق في الدراسات الاستقصائية القائمة metagenomic من مختلف البيئات البرية والمائية. تصور البروتوكول هنا سوف تنتج الحمض النووي المسمى ذات نوعية كافية لهذه التطبيقات المعتمدة على الاكتشاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق المنح والمشاريع الاستراتيجية لاكتشاف JDN من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Bromophenol Blue Reagent Fisher Scientific BP115-25
Cesium chloride Reagent Fisher Scientific BP210-500
Ethanol, reagent grade Reagent Sigma-Aldrich 652261
Ethidium bromide Reagent Sigma-Aldrich E1510
Hydrochloric acid Reagent Fisher Scientific 351285212
Linear polyacrylamide Reagent Applichem A6587
Polyethylene Glycol 6000 Reagent VWR international CAPX1286L-4
Potassium Chloride Reagent Fisher Scientific AC42409-0010
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S2711
Sodium Hydroxide pellets Reagent Fisher Scientific S3181
Tris base Reagent Fisher Scientific BP1521
Dark Reader Equipment Clare Chemical DR46B
Microcentrifuge Equipment Eppendorf 5424 000.410
Nanodrop 2000 Equipment Fisher Scientific 361013650
Infusion pump Equipment Braintree Scientific, Inc. N/A Model Number: BSP
See www.braintreesci.com for ordering details.
Tube sealer Equipment Beckman Coulter Inc. 358312
Ultracentrifuge Equipment Beckman Coulter Inc.
Ultracentrifuge rotor Equipment Beckman Coulter Inc. 362754
Ultraviolet light source Equipment UVP Inc. 95-0017-09 Any UV source will suffice
Ultraviolet light face shield Equipment Fisher Scientific 114051C
Butyl rubber stoppers, gray Material Sigma-Aldrich 27232
Centrifuge tubes Material Beckman Coulter Inc. 342412
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length Material BD Biosciences 305145
Microfuge tubes, 1.5 mL Material DiaMed AD151-N500
Open center seals, 20 mm diameter Material Sigma-Aldrich 27230-U
Pasteur pipettes, glass Material Fisher Scientific 13-678-6C
Pipet tips Material DiaMed BPS340-1000 Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall Material Appleton Woods
Screw-cap tubes, 15 mL Material DiaMed AD15MLP-S
Serum vials, 125 mL volume Material Sigma-Aldrich Z114014
Syringe, 60 mL Material BD Biosciences 309653

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
  2. Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
  3. Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
  4. Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
  5. Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
  6. Haichar, elZ. ahar, F, Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
  7. Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
  8. Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
  9. Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
  10. Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
  11. Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
  12. Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
  13. Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
  14. Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
  15. Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
  16. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
  17. Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).
  18. Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
  19. Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.

Tags

علم الأحياء المجهرية ، العدد 42 ، الإيكولوجيا الميكروبية DNA - النظائر مستقرة تحقق ، علم الأحياء المجهرية ، وزراعة مستقلة ، metagenomics ، 16S الرنا الريباسي تحليل الجينات المجتمع ، ركائز والبيئة الميكروبية ، والإثراء
DNA - النظائر المستقرة جس (DNA - SIP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA… More

Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), e2027, doi:10.3791/2027 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter