Summary
DNA-stabiele isotoop sonderen is een teelt-onafhankelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van actieve gemeenschappen van micro-organismen die in staat zijn gebruik te maken van specifieke substraten. Assimilatie van de ondergrond verrijkt met zware isotoop leidt tot opname van gelabelde atomen in de microbiële biomassa. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie haalt gelabeld DNA voor de downstream-moleculaire analyses.
Abstract
DNA-stabiele isotoop indringende (DNA-SIP) is een krachtige techniek voor het identificeren van actieve micro-organismen die bepaalde koolstofsubstraten en voedingsstoffen te assimileren in cellulaire biomassa. Als zodanig is deze teelt-onafhankelijke-techniek is een belangrijke methode voor het toewijzen van metabolische functie om de diverse gemeenschappen bewoont een breed scala van terrestrische en aquatische milieus. Na de incubatie van een milieu-monster met een stabiele isotoop-gelabelde stoffen, wordt gewonnen nucleïnezuur onderworpen aan dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en de daaropvolgende helling fractionering aan nucleïnezuren van verschillende dichtheden scheiden. Zuivering van DNA van cesium chloride ophaalt gelabeld en ongelabelde DNA voor verdere moleculaire karakterisering (bijvoorbeeld vingerafdrukken, microarrays, kloon bibliotheken, metagenomica). Deze video Jove protocol biedt visuele stap-voor-stap uitleg van het protocol voor de dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, gradiënt fractionering en herstel van gelabelde DNA. Het protocol bevat ook proeven van SIP-gegevens en belicht belangrijke tips en waarschuwingen die moeten worden beschouwd als een succesvolle DNA-SIP-analyse te garanderen.
Protocol
1. Voorbereiding van de reagentia
DNA-SIP vereist het gebruik van de reagentia die moeten worden voorbereid op voorhand van de werkelijke procedure. De aanwijzingen voor het bereiden van elk reagens worden in deze sectie en zijn gewijzigd van een vorige SIP-protocol 1.
- Cesium chloride (CSCL) oplossing voor het bereiden van SIP hellingen - Voorbereiden van een 7.163 M oplossing CsCl door geleidelijk aan het oplossen van 603,0 g CsCl in gedestilleerd en gedeïoniseerd water (DDH 2 O) tot een uiteindelijk volume van 500 ml. Wees voorzichtig dat u 500 ml overtreffen! Opwarming van de oplossing een beetje al roerend zal helpen bij het oplossen van alle CsCl. Aliquot de uiteindelijke oplossing in gesloten fracties. In ons lab, een gemeenschappelijke opslagplaats praktijk is op 100-mL monsters voor te bereiden in 125-mL serum flesjes, die vervolgens worden krimp-afgesloten met butyl rubberen stop. De verzegelde monsters kan onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur (20 ° C). De zeehonden helpen bij het voorkomen en verdamping CsCl "korst" formatie. Bepaal de dichtheid van de oplossing door middel van wegen drievoud 100-ui aliquots, of door gebruik te maken van een digitale refractometer (bijv. Reichert AR200), die zorgvuldig is gekalibreerd voor CsCl oplossingen. Een keer met succes gekalibreerd, de Reichert AR200 is consistent en biedt nauwkeurige metingen voor meerdere jaren. Bij kamertemperatuur (20 ° C), de laatste dichtheid van deze oplossing varieert meestal 1.88 tot 1.89 g ml -1. De dichtheid varieert enigszins elke keer een nieuwe foto wordt voorbereid.
- Cesium chloride-oplossing voor het bereiden van hellingen met ethidiumbromide (EtBr) - Combineer 250 g CsCl met 250 ml steriele DDH 2 O water. Aliquot deze oplossing in afzonderlijke serum flesjes die krimp-afgesloten geweest met butyl rubber afdichtingen, zoals beschreven in 1.1.
- Gradient Buffer - Combineer 50 ml van 1 M Tris-HCl, 3,75 g KCl en 1 ml van 0,5 M EDTA tot 400 ml water. Los van de KCl, voeg dan DDH 2 O tot 500 ml. Filter-steriliseren en autoclaaf. De uiteindelijke oplossing is 0,1 M Tris, 0.1 M KCl en 1 mM EDTA.
- Polyethyleenglycol (PEG)-oplossing - Bereid de PEG-oplossing door het oplossen van 150 g polyethyleenglycol 6000 en 46,8 g NaCl in een steriele DDH 2 O water tot een totaal volume van 500 ml (30% PEG, 1,6 M NaCl). Autoclaaf.
Opmerking: Deze oplossing scheidt in twee fasen met autoclaaf. Voeg een roerstaafje in de geautoclaveerde fles, zodat de oplossing goed kan worden gemengd wanneer dit gebeurt. - TE Buffer - Bereid een oplossing van 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA (pH 8,0) in een steriele DDH 2 O water, met behulp van geautoclaveerd voorraad oplossingen van 1 M Tris-HCl (pH 8,0) en 0,5 M EDTA ( pH 8,0). Filter steriliseren en autoclaaf.
- 70% Ethanol - Combineer 350 ml zeer zuiver ethanol met 150 ml steriele DDH 2 O water.
2. Monster Incubatie-en DNA-extractie
Voor DNA-SIP incubaties, worden monsters meestal geïncubeerd met zware-isotoop koolstof (13 C) substraat. Incubatietijd en voorwaarden (bv. voedingssupplementen, vocht, licht) is afhankelijk van het type monster dat is geïncubeerd en de aard van de ondergrond. DNA-SIP experimenten zijn met succes uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van enkele koolstof verbindingen 2,3, multi-koolstofverbindingen 4,5,6, en het gebruik van gelabelde stikstof 7,8 of zuurstof 9. Echter, een nadeel aan het gebruik van 15 of 18 N-O-gelabelde stoffen is de verminderde fysieke scheiding van gelabelde nucleïnezuur, voornamelijk als gevolg van de aanwezigheid van minder stikstof-en zuurstofatomen in DNA en RNA ten opzichte van koolstofatomen.
Een kritische controle voor DNA-experimenten SIP is een identiek incubatie opgericht met native (bijvoorbeeld 12 C) substraat. Dit incubatie biedt een volgende vergelijking om ervoor te zorgen dat elk schijnbaar etikettering van nucleïnezuur niet een artefact van de ultracentrifuges of G + C gehalte dichtheidsverschillen in het DNA bij te dragen aan scheiding 10. Het is ook belangrijk om bevroren monster materiaal te houden voor vergelijking met de 'lichte' en 'heavy' DNA, en de moeite waard met een no-substraat controle om achtergrond veranderingen in de populaties te beoordelen in de SIP-incubatie.
- Incubeer het milieu monsters in microkosmos met het label substraat (figuur 1). In onze ervaring, hebben we ontdekt dat een minimale opname van tussen de 500-500 umol 13 C koolstof per gram monster zal geschikt zijn voor monsters met hoge biomassa zoals bodemmonsters 1. Voor aquatische monsters met minder biomassa dan de bodem, kan 100 tot 100 umol opgenomen 13 C koolstof per liter leveren een aantoonbare zware isotopen signatuur 1. De hoeveelheid koolstof amendement, zal deel van de koolstof opgenomen in biomassa en behoefte aan aanvullende voedingsstoffen aanvulling voor assimilatie allemaal afhankelijk van de kenmerken van de monsters geanalyseerd en de beoogde organisms van belang. Een set van het monster incubatie richtlijnen niet van toepassing voor alle monsters. Belangrijk is dat de substraat concentratie gebruikt worden voor SIP incubatie idealiter zo dicht mogelijk bij de concentratie die gewoonlijk in situ; experimentele vooringenomenheid kan een gevolg zijn van verrijking kweekomstandigheden 10.
- Na de incubatie van het monster met een stabiele isotoop gemerkte substraat-, extract DNA van microkosmos met behulp van een streng-extractie protocol (voor PCR of kleine insert klonen) of een vertrouwde enzymatische lysis voor high-moleculair gewicht klonen (bijvoorbeeld grote-insert metagenomica). RNA co-extractie over het algemeen geen invloed op de analyse, zodat protocollen die opbrengst RNA en DNA kan worden gebruikt. De ultracentrifugatie van de geëxtraheerde DNA zal niet afschuiving fragmenten korter dan ~ 50 kb paren 1.
- Kwantificeren geëxtraheerde DNA voorafgaand aan de installatie van de CsCl gradiënt ultracentrifugatie buizen. Kwantificeren DNA met behulp van een spectrofotometer (bijv. Nanodrop 2000) als de extractie protocol geeft alleen DNA (bv kolom op basis van kits). Als alternatief, te kwantificeren met behulp van agarose gelelektroforese.
3. Voorbereiden Gradient Oplossingen voor Ultracentrifugatie
Deze procedure omvat het toevoegen van DNA aan buizen ultracentrifuge. Er zijn meer dan een type van de buis en de rotor, zodat de exacte protocol zal variëren en is afhankelijk van de instructies van de fabrikant. Dat gezegd hebbende, adviseren wij het gebruik van een verticaal goed rotor maximaal eventuele scheiding van lichte en zware DNA te verzekeren. We maken gebruik van een Beckman Coulter-Vti 65,2 rotor met 16 putten voor het houden van 5,1 ml QuickSeal Polyallomer buizen en het protocol zal de stappen en overwegingen voor deze voorwaarden.
- Met behulp van de DNA-concentraties bepaald in stap 2.3, het berekenen van de benodigde hoeveelheid geëxtraheerde DNA die nodig is om 0,5 ug te bieden - 5 ug van DNA in de ultracentrifuge buizen.
- Combineer geëxtraheerde DNA (0,5 - 5 pg) met Gradient Buffer (zie stap 1.3) en 4,8 ml 7,163 M CsCl tot een totaal volume van ~ 6 ml in een steriele disposable 15-ml-buis. Merk op dat de dichtheid van de CsCl oplossing, zelfs kan variëren op dezelfde molariteit (zie stap 1.1). De volgende vergelijking kan worden gebruikt om het volume van de Gradient Buffer / DNA-mengsel dat nodig is om een juiste mengverhouding gegenereerd moet worden:
Gradient buffer en DNA-oplossing volume (ml) = (CsCl voorraadoplossing dichtheid - gewenste uiteindelijke dichtheid) x volume van de CsCl stockoplossing toegevoegd x 1,52
Geef het volume van de CsCl voorraad oplossing bij 4,80 ml. De gewenste einddichtheid moet worden 1.725 g ml -1. De stockoplossing dichtheid werd bepaald in stap 1.1.
Merk ook op dat de relatieve volumes van CsCl en Gradient Buffer / DNA zal resulteren in een gecombineerde volume van meer dan 5,1 ml. Voorbereiden van volumes groter is dan het maximum volume capaciteit van de ultracentrifuge buizen (groter dan 5,1 ml) zal ervoor zorgen dat er voldoende oplossing om volledig vullen van de buis. - Meng door 10 keer. DNA is stabiel bij kamertemperatuur in CsCl.
4. Het creëren van een EtBr controle Gradient (optioneel)
Omdat EtBr is een inlassen kleurstof die complexen met DNA zodat het zichtbaar onder UV-licht, de controle hellingen met EtBr zijn nuttig omdat ze directe visuele bevestiging van de gradiënt vorming voorafgaand aan de fractionering van monsterbuizen (bijv. Figuur 1). De opname van een controle-buis die EtBr en een mengsel van beide 12 C-DNA en 13 C-DNA (of 14 N-DNA en 15 N-DNA) maakt voor onmiddellijke weergave van de band formatie binnen de buizen na afloop van ultracentrifugatie. Dit is belangrijk omdat een gescheurde buis tijdens de ultracentrifuges of verkeerd geprogrammeerd lopen omstandigheden kan resulteren in een mislukte gradiënt formatie. Gebonden aan DNA, EtBr verlaagt de dichtheid van het DNA en als gevolg daarvan, een ander protocol wordt gevolgd om gradiënten te bereiden. Merk op dat andere nucleïnezuur vlekken kunnen in plaats van EtBr 11 worden gebruikt, maar het protocol optimalisatie vereisen met andere fluoroforen.
- De controle gradiënt vereist twee volumes van genomisch DNA: een volledig gelabeld met stabiele isotopen en een zonder label. We gebruiken meestal ofwel Sinorhizobium meliloti gekweekt in media met daarin 13 C-of 12 C-glucose als enige koolstofbron, of Methylococcus capsulatus stam Bath gekweekt in de aanwezigheid van 13 C-12 of C-methaan als onze controles.
- Combineer een 5 -10 microgram hoeveelheid van zowel de 12 C-DNA en 13 C-DNA met Verloop Buffer tot een uiteindelijk volume van 1,00 ml in een wegwerp 15-ml schroefdop tube.
- Voeg 1,00 g vaste CsCl om dezelfde buis. Meng door inversie.
- Voeg 110 ulvan een 10 mg ml-1 EtBr oplossing en 4,3 ml van een 1 g ml-1 CsCl stockoplossing aan dezelfde schroefdop buis gebruikt in stap 4.2. De uiteindelijke dichtheid van de oplossing zal bij benadering die van het origineel CsCl stamoplossing.
- Een extra "blanco" controle-oplossing bevat EtBr zal ook nodig zijn om tegenwicht te bieden de oplossing die u in stap 4.4. Combineer 1,00 mL van Gradient Buffer, 1,00 g CsCl, 110 pl van een 10 mg ml-1 EtBr oplossing en 4,3 ml van een 1 g ml-1 CsCl voorraad oplossing via een aparte 15 ml schroefdop tube en meng door inversie.
5. Ultracentrifugatie
- Met behulp van een gloeilamp en Pasteur pipet voorzichtig vullen ultracentrifuge buizen met gradiënt-oplossingen bereid in stap 3.2 (of stappen 4.4 wordt, indien de voorbereiding van een EtBr controle gradiënt). Voeg voorzichtig de oplossingen voor de buizen met behulp van een Pasteur pipet. Label de buizen op de buis schouder met een fijne permanent marker. LET OP: Zorg ervoor dat de buizen precies gevuld tot de onderkant van de buis nek. Onvoldoende gevulde buizen zullen waarschijnlijk barsten tijdens ultracentrifugatie.
- Wanneer alle benodigde buizen zijn gevuld met het monster oplossingen, noteert u de exacte massa van elke buis. Paar buizen en balans hen om binnen de 0-10 mg. Voor het in evenwicht, vind bijna matched pairs en voegen of te verwijderen kleine hoeveelheden van de oplossing tot ze in evenwicht, waardoor de oplossing niveau zo dicht mogelijk bij de onderkant van de buis halzen mogelijk te maken. Merk op dat voor het wegen van buizen, hebben we een omgekeerde 15-ml schroefdop buis die is in de helft gesneden als een buis houder voor de balans te gebruiken.
- Sluit de buizen met behulp van een 'tube topper' volgens de instructies van de fabrikant.
- Controleer of de buizen goed zijn afgedicht door het omkeren van hen en het toepassen van matige druk. Opnieuw wegen de buizen om te controleren of ze nog steeds in balans na afdichting tot op 0-10 mg.
- Goed Controleer elke rotor zorgvuldig om ervoor te zorgen dat de putten schoon zijn en vrij van vuil of stof die zouden kunnen doorboren de buizen tijdens ultracentrifugatie.
- Plaats de buizen in de rotor met de evenwichtige paren tegenover elkaar. Noteer de rotor locatie van elk monster, omdat het ultracentrifugatie proces kan marker etiketten die worden beschadigd of gewist. Voorzichtig afdichting van de rotor putten zoals aangegeven door de fabrikant.
- Laad de rotor in de ultracentrifuge. Sluit de ultracentrifuge deur en toepassen van een vacuüm. Bij gebruik van een Vti 65,2 rotor, stelt u de rotatiesnelheid aan 44.100 toeren per minuut (~ 177.000 xg av), de temperatuur op 20 ° C, en ultracentrifugatie tijd voor 36-40 uur. Selecteer vacuüm, maximale versnelling, en zet de rem (zorgt voor gradiënt niet verstoord door vertraging). Merk op dat het uitschakelen van de rem wordt een extra 1-2 uur toe te voegen aan de looptijd. Merk ook op dat kortere doorlooptijden mogelijk niet voldoende band resolutie te verkrijgen. Lange runs ultracentrifugatie worden aanbevolen, omdat ze leiden tot een grotere resolutie van verschillende nucleïnezuur bands.
- Onmiddellijk na afloop van de ultracentrifugatie procedure, verwijder voorzichtig de rotor. Het vermijden van kantelen of stoten van de rotor, verwijder voorzichtig buizen van de rotor om te voorkomen dat verstoring van de gradiënten in de buizen. In zeldzame gevallen zal een buis barsten tijdens de run. Zo ja, is er een kans dat de hellingen in de andere buisjes het niet goed te vormen. Als er een controle gradiënt was opgenomen, zorgvuldig te controleren deze buis onder UV-licht op verloop formatie te bevestigen. Als de helling is niet goed gevormd in de controle-buis, is het best om alles herhalen van stap 5. Merk op dat de EtBr controle buis en de blanco controle kunnen worden opgeslagen in het donker en hergebruikt voor maximaal zes maanden. Zorg ervoor dat de rotor zorgvuldig reinigen volgens de instructies van de fabrikant als de burst buis is verwijderd. Gebruik geen metalen borstels of schuurmiddelen om de rotor putten schoon om krassen te voorkomen dat de rotor putten! Rotor-specifieke borstels en reiniging oplossing kan worden gekocht van Beckman.
6. Gradient Fractionering
Er zijn twee methoden die momenteel worden gebruikt om DNA te herstellen van de ultracentrifuge buizen: fractionering en naald extractie. Dit protocol zal alleen beschrijven het proces van het extraheren van DNA met behulp van de fractionering techniek. Dit komt omdat voor de meeste SIP-experimenten, gelabeld DNA niet kan worden gevisualiseerd met EtBr en moeten in plaats daarvan worden opgespoord door het vergelijken van gelijkwaardige lichte en zware fracties van meerdere monsterbuizen. Een spuit pomp is zeer aan te bevelen om gelijke dichtheidsgradiënt fracties halen uit ultracentrifuge buizen. We maken gebruik van een BSP model infusiepomp (Braintree Scientific Inc.) Een low-flow peristaltische pomp of een HPLC-pomp kan ook worden gebruikt.
- Vul een steriele 60 ml spuit met steriele DDH 2 O met voldoende broomfenol blauwe kleurstof om een donkere blauwe kleur te geven. Plaats de spuit op de laadarm van de injectiepomp.Bevestig de pomp buis voorzien van een 23-gauge 1 "naald en zet de pomp tot enkele DDH 2 O is gekomen tot het einde van de naald. Merk op dat alle luchtbellen in deze DDH 2 O aanbod negatief zal de fractionering van invloed zijn.
- Bevestig een van de ultracentrifugatie buizen aan een klem staan. Zorg ervoor dat de klem voldoende strak om de buis te voorkomen dat verplaatst, maar niet zodanig dat de druk op de buis zou een release van CsCl oplossing wanneer de buis doorboord veroorzaken. Pierce de onderkant van de buis langs de buis naad met behulp van een verse 23 gauge 1 "naald. Voor de beste resultaten, doorboren de buis in een gecontroleerde, snel en vol vertrouwen manier. Dit is erg moeilijk om goed te doen, oefen een paar keer eerder dit is de eerste poging met monsterbuizen.
- Voor elk monster, bereiden 12 steriele 1,5 ml microcentrifugebuizen met etiketten waarop het monsternummer en fractie (1-12, zware aan het licht). Met behulp van de naald aan de pomp slang (stap 6.1), doorboren de bovenkant van de buis op de bovenste buis schouder, langs de naad. Verzamel de gradiënt oplossing met behulp van de microcentrifugebuizen. Zoals uitgevoerd voor de onderkant van de buis, doorboren de buis op een snelle en gecontroleerde manier. De praktijk op voorhand en heel voorzichtig aan een gecontroleerde trekkende beweging te gebruiken om de gedwongen naald te voorkomen dat die door de buis en in een vinger! Gebruik een eerder gekalibreerde pomp tarief dat 12 x 425 ul fracties zullen opleveren in 12 minuten (425 pl min -1).
- Gebruik een digitale refractometer (bijv. Reichert AR200, aanbevolen) of een analytische balans om de dichtheid van de fracties controleren van de ene helling naar de juiste verloop formatie te bevestigen. U moet ~ 50 pi van het monster te gebruiken voor deze test. We bevatten vaak reincultuur DNA in een buis (zoals beschreven voor de voorbereiding van de EtBr controle gradiënten), om te dienen als een controle voor fractionering en gebruik dit voor de dichtheid bepalen. Verwachten dat de dichtheden varieert van ~ 1,690-1,760 g ml-1, met een gemiddelde dichtheid van ~ 1.725 g ml -1.
7. DNA Neerslag
- Neerslag DNA van alle fracties door eerst toe te voegen 20 ug van lineaire polyacrylamide als een drager voor neerslag. Meng door inversie. Voeg 2 volumes van de PEG-oplossing (zie stap 1) en meng door inversie. Merk op dat een drager voor neerslag (bijv. glycogeen of lineaire polyacrylamide) is van cruciaal belang voor de kwantitatieve het herstel van DNA uit gradiënt facties, maar voorzichtigheid moeten worden gebruikt als glycogeen wordt gebruikt als een drager voor neerslag voor dit protocol. Glycogeen voorbereidingen zijn aangetoond dat besmet is met bacteriën nucleïnezuur en vervuiling kan gemakkelijk verwarren de interpretatie van de SIP-gradiënt fracties 12.
- Laat de buizen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om het DNA te laten neerslaan. Indien gewenst, kan tubes 's nachts worden gelaten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 30 minuten met de achterkant van de buizen naar buiten voor een consistente buis oriëntatie in de rotor. Zorgvuldig aspireren en gooi het supernatant. Een pellet zichtbaar moet zijn, maar kan heel moeilijk te zien in dit stadium. Werken onder een felle lichtbron (bijv. bureaulamp) om te helpen bij het visualiseren van de pellet.
- Was de pellet met 500 ul van 70% ethanol. Centrifugeer bij 13.000 g gedurende 10 minuten. Zorgvuldig aspireren en gooi het supernatant. De pellet zal meestal meer zichtbaar zijn voor deze stap, maar zal distantiëren van de buiswand gemakkelijker.
- Laat de pellet bij kamertemperatuur drogen gedurende 15 minuten.
- Suspend elke pellet in 50 ul van TE-buffer (zie stap 1.5). Run 5 ul van elke fractie op een agarosegel volgens standaard lab protocollen.
8. Fractie Karakterisering
De methode die wordt gebruikt op verloop fracties karakteriseren aan het succes van een SIP-incubatie te beoordelen zal variëren afhankelijk van het laboratorium en de beschikbaarheid van de apparatuur. Met behulp van een vingerafdruk methode voor het richten van de 16S rRNA-gen is een gezamenlijke aanpak en methoden, zoals terminale restrictie fragment lengte polymorfisme (T-RFLP) of denaturerende gradiënt gel elektroforese (DGGE) geschikt zijn (figuur 1). Naar aanleiding van het protocol zoals hierboven beschreven, verwachten dat het licht DNA geassocieerd te worden met breuken 9-11 (~ 1,705-1,720 g ml -1) en de zware DNA-vingerafdrukken geassocieerd te worden binnen de fracties 5-8 (~ 1,720-1,735 g ml-1 ). Unieke vingerafdrukken in verband met breuken 5-8 van stabiele isotopen-bebroede monsters, maar niet met native-substraat geïncubeerd controles levert sterk bewijs koppelen van specifieke organismen met het metabolisme van bepaalde gelabeld substraat. Indien er onvoldoende gelabeld DNA blijft voor sommige toepassingen (hybridisatie, metagenomica), kunnen meerdere verplaatsing versterking worden gebruikt voor de productie van grotere hoeveelheden 13-15, maar dit kan hersenschimmen te introduceren in het geamplificeerde DNA 14,16.
Typische DNA-SIP resultaten zullen aantonen dat er een scheiding van gelabeld en niet-gemerkt DNA in de gradiënt gevormd door ultracentrifugatie. In het ideale geval zal volledige resolutie met een hoog molecuulgewicht genetisch materiaal (bijvoorbeeld 13 C, 15 N) uit ongelabelde materialen worden bereikt. Resolutie kan visueel getuige door het observeren van band-vorming in EtBr controle buizen. De concentraties van de opgehaalde genomisch DNA opgenomen in het individuele verloop fracties kunnen ook worden gebruikt voor een correcte verloop formatie te bevestigen.
Voor dit protocol, we onder meer representatieve resultaten van de gradiënt ultracentrifugatie uitgevoerd met behulp van nucleïnezuur uit twee zuivere culturen (figuur 2). De gefractioneerde gradiënt hier opgenomen werd bereid met behulp van genomisch DNA uit S. meliloti (ATCC 1021), en 13 C-gelabeld M. capsulatus str. Bad. Na ultracentrifugatie, fractionering en DNA-herstel, gelabeld en ongelabelde genomische DNA te scheiden in respectieve gradient fracties met verschillende dichtheden (figuur 2A). Zwaar isotoop gemerkte DNA kan worden waargenomen in fracties 4-5, terwijl ongelabelde DNA komt in hoge concentraties in fracties 9-10. Het DNA van elke fractie werd gekenmerkt door denaturerende gradiënt gel elektroforese 17 en de PCR-geamplificeerde producten gegenereerd discrete banding patronen die overeenkomen met de twee organismen opgenomen in het verloop (Figuur 2B). De dichtheid van de fracties varieerde van ~ 1,580 tot 1,759 g ml -1, en ze worden getoond in volgorde van afnemende dichtheid van links naar rechts.
Hoewel de scheiding van pure 13 C-en 12 C-DNA kan worden uitgesproken (figuur 2), kan het milieu monster incubaties zijn moeilijker te interpreteren. We bijvoorbeeld geïncubeerd toendra bodem van Resolute Bay (Nunavut, Canada) met ofwel 12 C-of 13 C-gelabeld glucose voor een periode van 14 dagen bij 15 ° C. De agarose gels van het gezuiverde gradiënt fractie DNA aangetoond dat genomische DNA was 'uitgesmeerd' over fracties 70-10 voor zowel de 12 C-13 en C-incubatie (Figuur 3A en 3C, respectievelijk). In dit geval kan 13 C-verrijking van biomassa uit bepaalde microbiële taxa alleen worden bepaald met een aanpak, zoals DGGE van 16S rRNA genen. De 12 C-glucose geïncubeerd bodem DNA genereert vergelijkbare patronen in alle gradiënt fracties (Figuur 3B), maar de 13 C-glucose geïncubeerd sample gegenereerd DGGE vingerafdrukken die uniek zijn in verband met breuken 5-8 (Figuur 3D). Van bijzonder belang zijn de geconserveerde bands aangegeven door de pijltjes. Deze dominante 'phylotype' is consistent in alle gradiënt fracties, maar verschuift naar zwaardere fracties voor DNA verkregen uit 13 C-glucose geïncubeerd bodem. Latere DNA-sequencing van deze band en / of kloon bibliotheek analyse zou bevestigen de identiteit van deze bijzondere 16S rRNA-gen en te begeleiden latere metagenomic of teelt-gebaseerde benaderingen.
Figuur 1. Schets van een DNA-SIP experiment met monster incubatie, DNA-extractie, CsCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en DNA-karakterisering met moleculaire technieken.
Figuur 2. Verwachte resultaten voor een SIP-gradiënt fractionering met inbegrip van DNA uit twee zuivere culturen. (A) Hoeveelheden van DNA van de gradiënt fracties 1-12 werden uitgevoerd op een 1% agarosegel van een helling met 13 C-gelabeld M. capsulatus stam Bath (fracties 4-6) en 12 C-gelabeld S. meliloti (fracties 8-10). Een 1-kb ladder voor vergelijking is opgenomen (B) PCR-geamplificeerd DNA uit dezelfde fracties werden uitgevoerd op een 10% DGGE gel. Vingerafdruk patronen laten zien duidelijke verschillen tussen de fracties 5 en 9, bijvoorbeeld.
Figuur 3. Verwachte resultaten voor de SIP-gradiënt fractioneringen uit grondmonster incubaties. Hoeveelheden van gradiënt fracties uit zowel de 12 C-glucose gewijzigd grond (A) en 13 C-glucose gewijzigd bodem (C) werden uitgevoerd op 1% agarose gels en een 1-kb ladder voor vergelijking is opgenomen. Overeenkomstige DGGE vingerafdrukken voor elk van deze monsters worden getoond in (B) en (D). Fingerprinting van fracties onthult verrijking van specifieke bacteriële taxa in de 13 C-glucose gewijzigd monster in fracties 5-8 (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Goed ontwerp van stabiele isotoop-probing experimenten is van cruciaal belang voor het verkrijgen van het label DNA boven de achtergrond ongelabelde gemeenschap. Overwegingen met betrekking tot incubatietijden, substraatconcentraties, incubatieomstandigheden (bv. voedingsstoffen, bodemvocht), cross-voeding en replicatie monster zijn elders 10,18 besproken en adviseren wij de lezer deze publicaties bij het ontwerpen van een SIP-incubatie. Gerelateerd aan de huidige protocol, is het de moeite waard commentaar op andere overwegingen met betrekking tot de interpretatie van de gegevens van SIP-gradiënten. Vanwege de aard van de ultracentrifugatie proces, is het bovendien belangrijk om controles zoals zuivere culturen en native-substraat geïncubeerd monsters bevatten om ervoor te zorgen dat de bands verschijnen of verdwijnen in het bijzonder fracties niet zijn artefacten van het protocol zelf. Kan bijvoorbeeld DNA in een ultracentrifuge gradiënt niet zichtbaar zijn in een agarose gel (figuur 2A), maar kan nog steeds vervuilen de volledige lengte van de gradiënt (Figuur 2B). Hoewel M. capsulatus patronen zijn het meest uitgesproken in de dichte fracties (5-7) van de gel weergegeven in figuur 2B, was hetzelfde patroon DGGE nog waargenomen in de lichtste fractie (12). Met zorgvuldig overwogen controles, de interpretatie van SIP gradiënt fractie van gegevens mogelijk is.
Vanwege de aard van een aantal goed opgezette SIP experimenten (bijv. in de buurt in situ substraatconcentraties, korte incubatietijden), kan isotoop opname erg laag 10. Daarnaast hebben de meeste micro-organismen in terrestrische of aquatische omgevingen hebben lange generatie tijden vergeleken met de groei in het laboratorium, en vereisen langere incubatietijd tot detecteerbare niveaus van isotopische verrijking te bereiken. Andere populaties kan in staat van metaboliserende een verscheidenheid van substraten, en mogen niet volledig worden groeien op gelabeld substraat. Er zijn ook gemeenschappen (bijvoorbeeld grondwater) die kunnen worden geassocieerd met lage biomassa en het genereren van een lage opbrengst van geëxtraheerde nucleïnezuur. In al deze gevallen kan de kwantitatieve ophalen van gemerkte nucleïnezuren een uitdaging zijn.
Om deze beperkingen te omzeilen, een verscheidenheid aan natuurlijke en synthetische drager moleculen die helpen bij de neerslag en het herstel van DNA van CsCl gradiënten. Carrier moleculen kunnen worden biologische oorsprong, zoals glycogeen of DNA van een organisme Archaea 19, of synthetische in de natuur, zoals de lineaire polyacrylamide. Het voordeel van het gebruik van carrier moleculen zoals deze bij het uitvoeren van DNA-SIP is dat ze kunnen visualisatie van bands in staat stellen in de CsCl gradiënten die normaal niet zichtbaar zijn en zorgen voor herstel van de kwantitatieve lage DNA concentraties. Een succesvol herstel van lage nanogram hoeveelheden DNA van CsCl gradiënten impliceert dat het gebruik van een dragermolecuul 1,12. Recent onderzoek heeft uitgewezen dat dragermoleculen verkregen uit biologische bronnen vaak besmet zijn met DNA van de bron organisme 12 en de resultaten zijn zeer moeilijk te onderscheiden van patronen verbonden met 13 C-gelabeld DNA (gegevens niet getoond). Daarom is het aanbevolen dat kunststof drager moleculen zoals lineaire polyacrylamide worden gebruikt voor DNA-SIP. Daarnaast kan het gebruik van multiple-verplaatsing amplificatie (MDA) te genereren high fidelity opbrengsten van de gelabelde DNA voor downstream-moleculaire analyses 13,14, hoewel chimeren kan worden gegenereerd door de versterking en ontdekt in downstream moleculaire analyses 14.
Een van de meest krachtige toepassingen van DNA-SIP, dat is nog niet ten volle worden benut is het potentieel herstel van DNA van actieve leden van de gemeenschap voor metagenomic bibliotheek analyse. We verwachten dat de belangrijkste vooruitgang in enzym ontdekking zal voortvloeien uit de integratie van stabiele isotoop-indringende in bestaande metagenomic enquêtes uit diverse terrestrische en aquatische omgevingen. Het protocol gevisualiseerde hier zal gelabeld DNA van voldoende kwaliteit te produceren voor deze ontdekking-gebaseerde applicaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Strategic Project en Discovery Subsidies voor JDN van het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman Coulter Inc. | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
References
- Neufeld, J. D.
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
- Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
- Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
- Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
- Haichar, elZ. ahar, F, Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
- Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
- Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
- Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
- Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
- Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
- Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
- Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
- Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
- Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
- Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).
- Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
- Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.
