Summary
आइसोटोप - स्थिर डीएनए जांच की खेती स्वतंत्र पहचान और सूक्ष्मजीवों कि विशिष्ट substrates का उपयोग करने में सक्षम हैं के सक्रिय समुदायों विशेषताएँ विधि है. भारी आइसोटोप में समृद्ध सब्सट्रेट के आत्मसात माइक्रोबियल बायोमास में लेबल परमाणुओं का समावेश करने के लिए होता है. घनत्व ढाल ultracentrifugation बहाव आणविक विश्लेषण के लिए लेबल डीएनए retrieves.
Abstract
स्थिर आइसोटोप डीएनए जांच (डीएनए घूंट) सक्रिय सूक्ष्मजीवों कि सेलुलर बायोमास में विशेष रूप से कार्बन substrates और पोषक तत्वों को आत्मसात की पहचान के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. जैसे, इस तकनीक की खेती स्वतंत्र स्थलीय और जलीय वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला inhabiting विविध समुदायों के लिए चयापचय समारोह असाइन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति किया गया है. स्थिर आइसोटोप लेबल यौगिकों के साथ एक पर्यावरण नमूने के ऊष्मायन के बाद, निकाले न्यूक्लिक एसिड घनत्व ढाल ultracentrifugation और बाद में ढाल fractionation के अधीन है भिन्न घनत्व की nucleic एसिड अलग. सीज़ियम क्लोराइड से डीएनए के शोधन लेबल और retrieves unlabelled बाद आणविक लक्षण वर्णन (जैसे फिंगरप्रिंटिंग, प्रोटीन, क्लोन पुस्तकालयों metagenomics,) के लिए डीएनए. यह जौव वीडियो प्रोटोकॉल घनत्व ultracentrifugation ढाल, ढाल fractionation और लेबल डीएनए की वसूली के लिए प्रोटोकॉल का दृश्य कदम दर कदम स्पष्टीकरण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल भी नमूना घूंट डेटा और महत्वपूर्ण सुझावों पर प्रकाश डाला गया शामिल हैं और चेतावनी देते हैं कि एक सफल विश्लेषण डीएनए घूंट सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए.
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
डीएनए घूंट अभिकर्मकों कि वास्तविक प्रक्रिया के अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए का उपयोग की आवश्यकता है. प्रत्येक अभिकर्मक की तैयारी के लिए निर्देश इस खंड में सूचीबद्ध हैं और पिछले एक घूंट प्रोटोकॉल 1 से संशोधित कर रहे हैं.
- घूंट gradients की तैयारी के लिए सीज़ियम क्लोराइड (CSCL) समाधान - धीरे - धीरे 500 एमएल की एक अंतिम मात्रा करने के लिए आसुत और विआयनीकृत पानी में 603.0 CSCL के g (2 हे DDH) भंग करके एक 7.163 एम CSCL समाधान तैयार. 500 एमएल से अधिक नहीं सावधान रहो! समाधान थोड़ा वार्मिंग जबकि सरगर्मी CSCL के सभी भंग में मदद करेगा. विभाज्य सील aliquots में अंतिम समाधान. हमारी प्रयोगशाला में, एक आम का भंडारण अभ्यास के लिए 125 एमएल सीरम शीशियों, जो तब समेटना Butyl रबड़ stoppers के साथ सील कर रहे हैं में 100 एमएल aliquots तैयार है. सील aliquots कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) पर अनिश्चित काल के संग्रहीत किया जा सकता है. जवानों वाष्पीकरण और CSCL "पपड़ी" गठन को रोकने में मदद. 100 - μL aliquots तीन प्रतियों वजन द्वारा, या एक डिजिटल (जैसे रीचर्ट AR200) refractometer है कि ध्यान CSCL समाधान के लिए calibrated किया गया है का उपयोग करके समाधान का घनत्व निर्धारण करते हैं. एक बार सफलतापूर्वक कैलिब्रेटेड, रीचर्ट AR200 संगत है और कई वर्षों के लिए सटीक रीडिंग प्रदान करता है. कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) में, इस समाधान के अंतिम घनत्व आमतौर पर 1.88-1.89 जी मिलीलीटर -1 से पर्वतमाला . घनत्व थोड़ा बदलता है हर बार एक नया स्टॉक तैयार है.
- बाँझ DDH 2 हे पानी की 250 एमएल के साथ CSCL के 250 ग्राम का मिश्रण - ethidium (EtBr) ब्रोमाइड के साथ gradients की तैयारी के लिए सीज़ियम क्लोराइड समाधान. विभाज्य अलग सीरम शीशियों कि समेटना सील Butyl रबड़ मुहरों के रूप में 1.1 में वर्णित के साथ किया गया है में इस समाधान.
- ग्रेडियेंट बफर - 1 Tris - एचसीएल एम, 3.75 छ KCl और 0.5 एम EDTA के 1 मिलीलीटर पानी की 400 मिलीलीटर की 50 मिलीलीटर का मिश्रण है. KCl भंग, तो 500 मिलीलीटर जोड़ने DDH 2 हे. फ़िल्टर - बाँझ और आटोक्लेव. अंतिम समाधान 0.1 एम Tris, 0.1 एम KCl और 1 मिमी EDTA है.
- Polyethylene glycol (खूंटी) समाधान - एमएल 500 (30% खूंटी, 1.6 एम NaCl) की कुल मात्रा के लिए बाँझ DDH 2 हे पानी में polyethylene glycol 6000 और NaCl के 46.8 ग्राम के 150 ग्राम भंग करके खूंटी समाधान तैयार . आटोक्लेव.
नोट: यह समाधान autoclaving के साथ दो चरणों में अलग है. Autoclaved बोतल में एक हलचल बार तो यह है कि समाधान ठीक हो सकता है जब यह तब होता है मिलाया जा शामिल है. - ते बफर - बाँझ DDH 2 हे पानी में 10 मिमी (8.0 पीएच) Tris - एचसीएल और 1 मिमी EDTA (पीएच 8.0) की एक समाधान तैयार, 1 Tris - एचसीएल एम (8.0 पीएच) और 0.5 एम EDTA के autoclaved शेयर समाधान का उपयोग कर ( 8.0 पीएच). बाँझ और आटोक्लेव फ़िल्टर.
- 70% इथेनॉल - बाँझ DDH 2 हे पानी की 150 मिलीलीटर के साथ उच्च शुद्धता इथेनॉल के 350 मिलीलीटर का मिश्रण.
2. नमूना ऊष्मायन और डीएनए निष्कर्षण
डीएनए घूंट incubations के लिए, नमूने आम तौर पर भारी आइसोटोप (13 सी) कार्बन सब्सट्रेट के साथ incubated हैं. ऊष्मायन अवधि और शर्तों (जैसे पोषक तत्वों की पूरकता, नमी, प्रकाश,) नमूने के प्रकार और incubated है कि सब्सट्रेट की प्रकृति पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. डीएनए - घूंट प्रयोगों को सफलतापूर्वक किया गया है एकल कार्बन यौगिकों 2,3, बहु कार्बन यौगिकों 4,5,6, और लेबल नाइट्रोजन 7,8 या 9 ऑक्सीजन का उपयोग करने की एक किस्म का उपयोग किया. हालांकि, 15 एन या 18 ओ लेबल यौगिकों का उपयोग करने के लिए एक कमी कमी आई लेबल न्यूक्लिक एसिड के भौतिक जुदाई, मुख्य रूप से कम नाइट्रोजन और ऑक्सीजन परमाणुओं में डीएनए और आरएनए कार्बन परमाणुओं के लिए रिश्तेदार की उपस्थिति के कारण है.
डीएनए घूंट प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण एक समान देशी सब्सट्रेट (जैसे 12 सी) के साथ स्थापित ऊष्मायन है . यह ऊष्मायन करने के लिए सुनिश्चित करें कि न्यूक्लिक एसिड के किसी भी स्पष्ट लेबलिंग ultracentrifugation या जी + 10 अलग करने के लिए योगदान डीएनए में सी सामग्री घनत्व मतभेद का एक artifact नहीं था बाद में एक तुलना प्रदान करता है. यह भी महत्वपूर्ण है 'प्रकाश' और 'भारी' डीएनए की तुलना के लिए जमे हुए नमूना सामग्री रखने के लिए, और कोई सब्सट्रेट नियंत्रण घूंट ऊष्मायन भर पृष्ठभूमि जनसंख्या परिवर्तन का आकलन सहित लायक है.
- लेबल सब्सट्रेट (चित्रा 1) युक्त लघु में पर्यावरणीय नमूनों सेते हैं. हमारे अनुभव में, हमने पाया है कि नमूने के प्रति ग्राम 13 सी कार्बन के 500-500 μmol के बीच की एक न्यूनतम समावेश मिट्टी एक नमूने के रूप में उच्च बायोमास युक्त नमूने के लिए उपयुक्त हो जाएगा. जलीय नमूने युक्त मिट्टी की तुलना में कम बायोमास के लिए, 1-100 μmol प्रति लीटर 13 सी कार्बन शामिल की एक detectable भारी समस्थानिक एक हस्ताक्षर उपज सकता है . कार्बन संशोधन की राशि, बायोमास और आत्मसात के लिए पूरक पोषक तत्वों के अलावा के लिए आवश्यकता में शामिल कार्बन के अनुपात सभी विश्लेषण किया जा रहा नमूनों की विशेषताओं पर निर्भर होगा और लक्षित ओब्याज की rganisms. नमूना ऊष्मायन दिशा निर्देशों का एक एकल सेट सभी नमूनों के लिए लागू नहीं होगा. महत्वपूर्ण बात है, सब्सट्रेट घूंट ऊष्मायन के लिए इस्तेमाल किया एकाग्रता आदर्श रूप में संभव के रूप में आम तौर पर बगल में सामना की एकाग्रता के करीब होना चाहिए, प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह संवर्धन संस्कृति शर्तों के 10 के एक परिणाम हो सकता है.
- लेबल स्थिर आइसोटोप सब्सट्रेट के साथ नमूने की ऊष्मायन के बाद, एक कठोर निष्कर्षण प्रोटोकॉल (पीसीआर या छोटे डालने क्लोनिंग के लिए) या एक विश्वसनीय उच्च आणविक भार क्लोनिंग (जैसे metagenomics बड़े सम्मिलित करने के लिए) के लिए enzymatic lysis का उपयोग कर लघु से डीएनए निकाल सकते हैं. शाही सेना सह निकासी आम तौर पर विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता, तो प्रोटोकॉल है कि शाही सेना के रूप में डीएनए के रूप में अच्छी तरह से उपज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. निकाले डीएनए के ultracentrifugation कतरनी ~ 50 केबी एक जोड़े की तुलना में छोटे टुकड़े नहीं होगा.
- यों पहले निकाले डीएनए CSCL ढाल ultracentrifugation ट्यूबों के सेटअप. यों डीएनए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे 2000 Nanodrop) का उपयोग कर यदि निष्कर्षण प्रोटोकॉल पैदावार केवल डीएनए (जैसे आधारित स्तंभ किट). वैकल्पिक रूप से, यों agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग.
3. Ultracentrifugation के लिए ढाल समाधान की तैयारी
यह प्रक्रिया ट्यूबों ultracentrifuge एक डीएनए जोड़ने शामिल है. वहाँ ट्यूब और रोटर के एक से अधिक प्रकार के होते हैं तो सटीक प्रोटोकॉल भिन्न है और निर्माता के निर्देशों पर निर्भर करेगा. उस ने कहा, हम एक ऊर्ध्वाधर अच्छी तरह रोटर का उपयोग करने के लिए प्रकाश और भारी डीएनए की अधिकतम संभव जुदाई सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं. हम 16 कुओं के साथ 5.1 मिलीलीटर QuickSeal Polyallomer ट्यूबों धारण करने के लिए एक के Beckman कल्टर VTI 65.2 रोटर और उपयोग प्रोटोकॉल इन स्थितियों के लिए कदम और विचार प्रदान करेगा.
- डीएनए के ultracentrifuge एक ट्यूब में 5 μg - डीएनए 2.3 चरण में निर्धारित सांद्रता का प्रयोग, निकाले डीएनए 0.5 μg उपलब्ध कराने के लिए आवश्यक है कि अपेक्षित मात्रा की गणना.
- ढाल (1.3 कदम देखें) बफर और 7.163 एम CSCL के एक बाँझ डिस्पोजेबल 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक ~ 6 मिलीलीटर की कुल मात्रा 4.8 मिलीलीटर के साथ - निकाले डीएनए (5 μg 0.5) का मिश्रण. ध्यान दें कि CSCL समाधान के घनत्व भी एक ही molarity पर भिन्न कर सकते हैं (1.1 कदम देखें). निम्न समीकरण ढाल मिश्रण / बफर डीएनए है कि एक उचित मिश्रण अनुपात उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
ढाल और बफर डीएनए समाधान (एमएल) मात्रा = (CSCL शेयर समाधान घनत्व - वांछित अंतिम घनत्व) CSCL शेयर समाधान के x मात्रा 1.52 x गयी
4.80 मिलीलीटर में CSCL स्टॉक समाधान की मात्रा निर्दिष्ट करें. वांछित अंतिम घनत्व 1.725 ग्राम मिलीलीटर -1 होना चाहिए. शेयर समाधान घनत्व 1.1 चरण में निर्धारित किया गया था.
यह भी नोट कि CSCL और बफर डीएनए / ग्रैडिएंट के रिश्तेदार मात्रा से अधिक 5.1 मिलीलीटर की एक संयुक्त मात्रा में परिणाम होगा. Ultracentrifuge ट्यूबों की अधिकतम मात्रा क्षमता (अधिक से अधिक 5.1 मिलीलीटर) से अधिक संस्करणों की तैयारी सुनिश्चित करेंगे कि वहाँ पर्याप्त समाधान के लिए पूरी तरह से ट्यूब भरने. - Inverting 10 बार द्वारा मिक्स. डीएनए CSCL में कमरे के तापमान पर स्थिर है.
4. एक EtBr नियंत्रण ढाल (वैकल्पिक) बनाना
क्योंकि EtBr एक intercalating डाई है कि डीएनए के साथ परिसरों यह पराबैंगनी प्रकाश के तहत दिखाई बनाने, नियंत्रण EtBr युक्त gradients मददगार रहे हैं क्योंकि वे ढाल गठन के तत्काल दृश्य पुष्टि नमूना (जैसे चित्र 1) ट्यूबों के fractionation से पहले प्रदान करते हैं. ultracentrifugation के पूरा होने पर ट्यूब के भीतर एक नियंत्रण EtBr और दोनों 12 सी - डीएनए और 13 सी डीएनए (या 14 एन डीएनए और 15 एन डीएनए) के एक मिश्रण युक्त ट्यूब के शामिल किए जाने के बैंड के गठन के तत्काल दृश्य के लिए अनुमति देता है . यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ultracentrifugation या अनुचित तरीके से क्रमादेशित रन शर्तों के दौरान उठी ट्यूब में विफल रहा ढाल गठन में परिणाम कर सकते हैं. डीएनए के लिए बाध्य EtBr डीएनए के घनत्व को कम करती है और एक परिणाम के रूप में, एक अलग प्रोटोकॉल के लिए gradients तैयार करने के लिए पीछा किया जाता है. नोट करें कि अन्य न्यूक्लिक एसिड दाग EtBr 11 के बजाय प्रयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल अन्य fluorophores के साथ अनुकूलन की आवश्यकता होगी.
- एक पूरी तरह से स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल और एक लेबल के बिना: नियंत्रण ढाल जीनोमिक डीएनए के दो संस्करणों की आवश्यकता है. आम तौर पर हम या तो Sinorhizobium एकमात्र कार्बन स्रोत, या Methylococcus capsulatus तनाव स्नान 13 सी या हमारे नियंत्रण के रूप में सी - मीथेन 12 की मौजूदगी में सभ्य के रूप में 13 सी या 12 सी - शर्करा युक्त मीडिया में सुसंस्कृत meliloti का उपयोग करें.
- 5 -10 μg की मात्रा का मिश्रण दोनों 12 सी - डीएनए और 13 ढाल बफर के साथ एक डिस्पोजेबल 15 मिलीलीटर ट्यूब पेंच टोपी में 1.00 मिलीग्राम की एक अंतिम मात्रा करने के लिए सी - डीएनए.
- उसी ट्यूब के लिए ठोस CSCL के 1.00 छ जोड़ें. उलटा द्वारा मिक्स.
- 110 μl जोड़ेंएक 10 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 EtBr समाधान और एक 1 ग्राम मिलीलीटर -1 CSCL शेयर एक ही पेंच टोपी 4.2 चरण में इस्तेमाल ट्यूब समाधान के 4.3 मिलीलीटर की. कि लगभग मूल CSCL शेयर समाधान के समाधान के अंतिम घनत्व होगा.
- एक अतिरिक्त "रिक्त" नियंत्रण EtBr युक्त समाधान भी 4.4 चरण में बनाई गई समाधान counterbalance करने की आवश्यकता होगी. ग्रेडियेंट बफर, 1.00 CSCL के जी, एक 10 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 EtBr समाधान और एक 1 ग्राम मिलीलीटर एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब पेंच टोपी और उलटा द्वारा मिश्रण में -1 CSCL स्टॉक समाधान की 4.3 मिलीलीटर की 110 μl 1.00 एमएल मिश्रण.
5. Ultracentrifugation
- एक बल्ब और पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ध्यान से ढाल समाधान कदम 3.2 (या 4.4 कदम अगर एक EtBr नियंत्रण ढाल की तैयारी) में तैयार के साथ ultracentrifuge ट्यूबों को भरने. ध्यान ट्यूबों का उपयोग कर एक पाश्चर विंदुक करने के लिए समाधान जोड़ने. ठीक एक स्थायी मार्कर के साथ ट्यूब कंधे पर ट्यूबों लेबल. चेतावनी: सुनिश्चित करें कि ट्यूबों बिल्कुल ट्यूब गर्दन के आधार पर भरे हैं. Insufficiently भरा ट्यूबों ultracentrifugation के दौरान फट की संभावना हैं.
- जब आवश्यक ट्यूबों के सभी नमूना समाधान के साथ भर रहे हैं, प्रत्येक ट्यूब की सटीक जन रिकॉर्ड है. जोड़ी ट्यूब और उन्हें 0-10 मिलीग्राम के भीतर संतुलन. संतुलन के लिए, लगभग मिलान जोड़े को खोजने के लिए और जोड़ने या समाधान के मिनट मात्रा को हटाने, जब तक वे संतुलित कर रहे हैं, बंद के रूप में संभव के रूप में ट्यूब गर्दन के आधार पर समाधान स्तर रखने. ध्यान दें कि ट्यूबों वजन के लिए, हम एक औंधा 15 मिलीलीटर ट्यूब पेंच टोपी है कि शेष के लिए एक ट्यूब धारक के रूप में किया गया है आधे में कटौती का उपयोग करें.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक 'ट्यूब टॉपर' का उपयोग कर ट्यूब सील.
- जाँचें कि ट्यूबों ठीक से उन्हें inverting द्वारा सील कर रहे हैं और मध्यम दबाव लागू करने. ट्यूबों फिर से वजन की जाँच करने के लिए कि वे अभी भी 00-10 मिलीग्राम के भीतर करने के लिए सील के बाद संतुलित कर रहे हैं.
- प्रत्येक रोटर अच्छी तरह से ध्यान से जाँच करें सुनिश्चित करें कि कुओं स्वच्छ और मलबे या धूल से मुक्त हैं कि ultracentrifugation दौरान ट्यूब पंचर हो सकता है.
- रोटर में एक दूसरे के विपरीत संतुलित जोड़े के साथ ट्यूब डालें. प्रत्येक नमूने के रोटर स्थान रिकॉर्ड क्योंकि ultracentrifugation प्रक्रिया मार्कर लेबल क्षतिग्रस्त हो या मिटा पैदा कर सकता है. ध्यान से रोटर के रूप में निर्माता द्वारा संकेत कुओं को सील.
- Ultracentrifuge में रोटर लोड. Ultracentrifuge एक दरवाजा बंद करो और एक निर्वात लागू. यदि एक VTI 65.2 रोटर का उपयोग करते हुए, +४४,१०० rpm (~ 177.000 XG av), 20 ° 36-40 घंटे के लिए सी ultracentrifugation, और समय पर तापमान के लिए रोटेशन की गति सेट . निर्वात, अधिकतम त्वरण का चयन करें, और बंद ब्रेक बारी (मंदी से नहीं बाधित ढाल सुनिश्चित करता है). ध्यान दें कि बंद ब्रेक मोड़ एक अतिरिक्त 1-2 घंटे चलाते समय के लिए जोड़ देगा. यह भी ध्यान रखें कि कम रन समय पर्याप्त बैंड संकल्प को प्राप्त नहीं हो सकता है. लंबे ultracentrifugation रन की सिफारिश कर रहे हैं के रूप में वे विशिष्ट nucleic एसिड बैंड की अधिक से अधिक संकल्प के लिए नेतृत्व.
- तुरंत ultracentrifugation प्रक्रिया के पूरा होने पर, रोटर ध्यान से हटायें. किसी भी झुकने से बचना या रोटर के bumping, धीरे रोटर से ट्यूबों को हटाने के लिए ट्यूब के भीतर परेशान gradients से बचने. दुर्लभ परिस्थितियों में, एक ट्यूब चलाने के दौरान फट जाएगा. यदि हां, तो वहाँ एक मौका है कि अन्य ट्यूबों में gradients ठीक से फार्म नहीं था. यदि कोई नियंत्रण ढाल शामिल किया गया था, इस ट्यूब ध्यान से पराबैंगनी प्रकाश के तहत ढाल गठन की पुष्टि की जाँच करें. यदि ठीक से ढाल नियंत्रण ट्यूब में गठन किया गया है, यह सबसे अच्छा है के लिए चरण 5 के सभी दोहराने. ध्यान दें कि EtBr नियंत्रण ट्यूब और उसके रिक्त नियंत्रण अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है और अप करने के लिए छह महीने के लिए reused किया. ख्याल रखना रोटर ध्यान से निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बार फट ट्यूब हटा दिया गया है साफ. धातु ब्रश या अपघर्षक क्लीनर का उपयोग रोटर कुओं साफ क्रम में रोटर कुओं को खरोंच से बचने मत करो! रोटर विशेष ब्रश और सफाई समाधान के Beckman से खरीदा जा सकता है.
6. ढाल Fractionation
: वहाँ दो तरीकों कि वर्तमान ultracentrifuge एक ट्यूब से डीएनए वसूल करने के लिए उपयोग किया जाता है fractionation और सुई निकासी कर रहे हैं. यह प्रोटोकॉल केवल डीएनए निकालने fractionation तकनीक का उपयोग की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे. यह है क्योंकि सबसे घूंट प्रयोगों के लिए, लेबल डीएनए EtBr के साथ कल्पना नहीं हो सकता है और बजाय एकाधिक नमूना ट्यूब से बराबर प्रकाश और भारी भिन्न तुलना द्वारा पता लगाया जाना चाहिए कर सकते हैं. एक सिरिंज पंप अत्यधिक ultracentrifuge एक ट्यूब से बराबर घनत्व ढाल भिन्न वापस लाने के लिए सिफारिश की है. हम बसपा मॉडल जलसेक पंप (Braintree साइंटिफिक इंक) का उपयोग करें. एक कम प्रवाह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप या एक HPLC पंप भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- बाँझ DDH 2 हे पर्याप्त bromophenol नीले डाई करने के लिए एक गहरे नीले रंग प्रदान युक्त के साथ एक बाँझ 60 मिलीलीटर सिरिंज भरें . सिरिंज पंप के लोड हो रहा है बांह पर सिरिंज रखें.पंप एक 23 गेज-1 "सुई और पंप पर बारी जब तक कुछ DDH 2 हे सुई ध्यान दें कि इस DDH 2 हे आपूर्ति में किसी भी हवाई बुलबुले नकारात्मक fractionation प्रक्रिया को प्रभावित करेगा के अंत के माध्यम से आ गया है के साथ फिट टयूबिंग संलग्न.
- एक क्लैंप खड़ा करने के लिए एक ultracentrifugation ट्यूबों के ठीक. सुनिश्चित करें कि दबाना पर्याप्त तंग विस्थापित किया जा रहा से ट्यूब को रोकने ट्यूब पर ऐसी है कि दबाव जब ट्यूब छेदा है CSCL समाधान की रिहाई के कारण होता नहीं है, लेकिन. पियर्स ट्यूब सीवन के साथ ट्यूब के बहुत नीचे एक ताजा 23 एक गेज का उपयोग "सुई. श्रेष्ठ परिणामों के लिए, एक नियंत्रित, जल्दी, और विश्वास तरीके में पियर्स ट्यूब. यह बहुत अच्छी तरह से करना मुश्किल है, इससे पहले कई बार अभ्यास यह पहली बार नमूना ट्यूबों के साथ की कोशिश की है.
- प्रत्येक नमूना के लिए, नमूना संख्या और अंश (, प्रकाश को भारी 12/01) का संकेत लेबल के साथ 12 बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों तैयार. पंप टयूबिंग (6.1 चरण) से जुड़ा है, पियर्स ऊपरी ट्यूब कंधे पर ट्यूब के ऊपर सीवन के साथ, सुई का प्रयोग. ढाल समाधान का उपयोग microcentrifuge ट्यूबों लीजिए. ट्यूब के नीचे, बींधना एक त्वरित और नियंत्रित तरीके में ट्यूब के लिए प्रदर्शन किया. पहले अभ्यास और बहुत ही एक नियंत्रित खींच गति का उपयोग ट्यूब के माध्यम से गुजर से और एक उंगली में मजबूर सुई को रोकने के लिए सावधान रहना! पहले कैलिब्रेटेड पंप दर है कि 12 मिनट (425 μl मिनट -1) में 12 x 425 μl भिन्न निकलेगा का उपयोग करें.
- एक डिजिटल refractometer (जैसे रीचर्ट AR200, अनुशंसित) का उपयोग करें या एक विश्लेषणात्मक संतुलन के लिए एक ढाल से भिन्न के घनत्व की जांच करने के लिए उचित ढाल गठन की पुष्टि. आप इस परीक्षण के लिए नमूने के ~ 50 μl उपयोग की आवश्यकता होगी. हम अक्सर एक ट्यूब में शुद्ध संस्कृति डीएनए (के रूप में EtBr नियंत्रण gradients तैयारी के लिए वर्णित) fractionation के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा और घनत्व निर्धारण के लिए इस का उपयोग शामिल है. घनत्व ~ 1.690-1.760 ग्राम मिलीलीटर -1 से लेकर ~ 1.725 ग्राम मिलीलीटर -1 के एक औसत घनत्व के साथ अपेक्षा करें.
7. डीएनए वर्षा
- सभी भिन्न से पहले वर्षा के लिए एक वाहक के रूप में रैखिक polyacrylamide के 20 μg जोड़कर वेग डीएनए. उलटा द्वारा मिक्स. खूंटी समाधान के 2 संस्करणों (चरण 1 देखें) और उलटा द्वारा मिश्रण जोड़ें. ध्यान दें कि वर्षा के लिए एक वाहक (जैसे glycogen या रैखिक polyacrylamide) ढाल गुटों से डीएनए के मात्रात्मक वसूली के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन सावधानी अगर ग्लाइकोजन इस प्रोटोकॉल के लिए वर्षा के लिए एक वाहक के रूप में प्रयोग किया जाता है किया जाना चाहिए. Glycogen तैयारी बैक्टीरियल न्यूक्लिक एसिड के साथ दूषित होना दिखाया गया है और प्रदूषण आसानी से घूंट ढाल 12 भिन्न की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं.
- 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों वेग के लिए डीएनए की अनुमति छोड़ो. अगर वांछित, ट्यूब कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ा जा सकता.
- रोटर में एक सुसंगत ट्यूब उन्मुखीकरण के लिए बाहर का सामना करना पड़ ट्यूबों के पीछे के साथ 30 मिनट के लिए 13,000 जी अपकेंद्रित्र. ध्यान aspirate सतह पर तैरनेवाला त्यागने. एक गोली दिखाई हो सकता है, लेकिन बहुत मुश्किल हो सकता है इस स्तर पर देख सकते हैं चाहिए. एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत (जैसे डेस्क दीपक) के तहत कार्य को गोली visualizing में सहायता.
- 70% इथेनॉल 500 μl के साथ गोली धो लें. 10 मिनट के लिए छ १३००० अपकेंद्रित्र. ध्यान aspirate सतह पर तैरनेवाला त्यागने. गोली आमतौर पर इस कदम के लिए अधिक दिखाई होगा, लेकिन ट्यूब दीवार से और अधिक आसानी से अलग कर देना होगा.
- गोली कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
- ते बफर के 50 μl में प्रत्येक गोली निलंबित (1.5 कदम देखें). प्रयोगशाला मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक agarose जेल पर प्रत्येक अंश के 5 μl चलाएँ.
8. भिन्न विशेषता
ढाल भिन्न विशेषताएँ एक घूंट ऊष्मायन की सफलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया विधि प्रयोगशाला और उपकरणों की उपलब्धता के आधार पर अलग अलग होंगे. -16 RRNA जीन लक्ष्यीकरण के लिए एक फिंगरप्रिंटिंग विधि का प्रयोग एक आम दृष्टिकोण और टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई (टी RFLP) बहुरूपता या ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing जैसे तरीकों (DGGE) उपयुक्त हैं (चित्रा 1). प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित के बाद, 5-8 भिन्न (~ 1.720-1.735 ग्राम मिलीलीटर -1 के भीतर प्रकाश 9-11 भिन्न (~ 1.705-1.720 ग्राम मिलीलीटर -1) और भारी डीएनए उंगलियों के निशान के साथ जुड़े होने डीएनए जुड़े होने की उम्मीद ). अद्वितीय स्थिर आइसोटोप incubated नमूने के 5-8 भागों के साथ जुड़े उँगलियों के निशान नहीं है, लेकिन देशी सब्सट्रेट incubated नियंत्रण के साथ मजबूत विशेष रूप से लेबल सब्सट्रेट के चयापचय के साथ विशिष्ट जीवों को जोड़ने सबूत उपलब्ध कराता है. यदि अपर्याप्त डीएनए लेबल कुछ अनुप्रयोगों (संकरण metagenomics) के लिए रहता है, कई विस्थापन प्रवर्धन के लिए अधिक से अधिक मात्रा में उत्पादन 13-15 इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस प्रवर्धित 14,16 डीएनए में chimeras लागू कर सकते हैं.
विशिष्ट डीएनए घूंट परिणाम ultracentrifugation द्वारा गठित ढाल में लेबल और unlabelled डीएनए के एक अलग प्रदर्शन करेंगे. आदर्श रूप में, उच्च आणविक भार आनुवंशिक सामग्री के पूर्ण संकल्प unlabelled सामग्री से (एन 13 जैसे 15 सी,) प्राप्त किया जाएगा. संकल्प EtBr नियंत्रण ट्यूबों में बैंड के गठन को देख द्वारा नेत्रहीन देखा जा सकता है. पुनर्प्राप्त जीनोमिक डीएनए व्यक्तिगत ढाल भागों में निहित की सांद्रता भी उचित ढाल गठन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल के लिए, हम ढाल ultracentrifugation के प्रतिनिधि परिणाम दो शुद्ध संस्कृतियों (चित्रा 2) से न्यूक्लिक एसिड का उपयोग कर प्रदर्शन में शामिल हैं. fractionated ढाल यहाँ शामिल एस से निकाले जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर तैयार किया गया था meliloti, (1021 ATCC) और 13 सी - लेबल एम. capsulatus str. स्नान. बाद ultracentrifugation fractionation, और डीएनए वसूली, लेबल और जीनोमिक भिन्न घनत्व (2A चित्रा) के साथ संबंधित ढाल भागों में अलग डीएनए unlabelled. भारी - आइसोटोप लेबल डीएनए 4-5 भागों में मनाया जा सकता है, जबकि unlabelled डीएनए 9-10 भागों में उच्च सांद्रता में पाया जाता है. प्रत्येक अंश से डीएनए denaturing ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन 17 और पीसीआर प्रवर्धित असतत बैंडिंग ढाल (चित्रा 2B) में शामिल दो जीवों के लिए इसी पैटर्न उत्पन्न उत्पादों के साथ विशेषता थी . ~ 1.580 से लेकर भागों का घनत्व 1.759 ग्राम मिलीलीटर -1, और वे बाएँ से दाएँ घनत्व कम के क्रम में दिखाए जाते हैं.
हालांकि शुद्ध 13 की जुदाई सी और 12 सी - डीएनए (चित्रा 2) स्पष्ट किया जा सकता है, पर्यावरण नमूना incubations अधिक की व्याख्या करना कठिन हो सकता है. उदाहरण के लिए, हम incubated 15 में या तो 12 सी या 13 सी - लेबल एक 14 दिन की अवधि के लिए ग्लूकोज डिग्री सेल्सियस के साथ दृढ़ खाड़ी से मिट्टी (नुनावुत , कनाडा) tundra शुद्ध ढाल अंश डीएनए के agarose जैल दिखा दिया कि जीनोमिक डीएनए के लिए 7-10 भिन्न भर था 'गंदा' दोनों 12 सी और 13 सी - incubations (चित्रा 3A और 3C, क्रमशः) . इस मामले में, 13 सी विशेष माइक्रोबियल taxa से बायोमास के संवर्धन -16 rRNA जीन की DGGE जैसे एक दृष्टिकोण के साथ ही निर्धारित किया जा सकता है. 12 सी - ग्लूकोज incubated मिट्टी डीएनए सभी ढाल भिन्न (3B चित्रा) भर में समान पैटर्न उत्पन्न करता है, लेकिन 13 सी ग्लूकोज incubated नमूना DGGE उँगलियों के निशान है कि विशिष्ट 5-8 (चित्रा 3 डी) भिन्न के साथ जुड़े रहे हैं उत्पन्न. ब्याज की विशेष संरक्षित तीर द्वारा संकेत बैंड हैं. यह प्रमुख 'phylotype' सभी ढाल भिन्न लेकिन डीएनए के लिए भारी भिन्न 13 सी ग्लूकोज incubated मिट्टी से प्राप्त करने के लिए पाली के पार अनुरूप है . यह और / या क्लोन बैंड पुस्तकालय विश्लेषण के बाद डीएनए अनुक्रमण इस विशेष -16 rRNA जीन की पहचान की पुष्टि और बाद metagenomic या खेती - आधारित दृष्टिकोण मार्गदर्शन करेंगे.
चित्रा 1 डीएनए घूंट नमूना ऊष्मायन, डीएनए निष्कर्षण, CSCL घनत्व ढाल ultracentrifugation और आणविक तकनीक के साथ डीएनए लक्षण वर्णन शामिल प्रयोग के बाह्यरेखा.
चित्रा 2 एक घूंट ढाल fractionation के लिए दो शुद्ध संस्कृतियों से डीएनए सहित परिणाम की उम्मीद है . (ए) Aliquots ढाल 1-12 भिन्न से डीएनए के एक 1% agarose जेल पर एक 13 सी लेबल एम. युक्त ढाल से चलाए जा रहे थे capsulatus तनाव (भिन्न 4-6) स्नान और 12 एस सी लेबल meliloti (8-10 भिन्न). एक सीढ़ी 1-केबी तुलना के लिए शामिल है, (बी) एक ही भिन्न से डीएनए पीसीआर प्रवर्धित थे 10% DGGE जेल पर चलने. फिंगरप्रिंट पैटर्न उदाहरण के लिए भिन्न 5 और 9 के बीच स्पष्ट मतभेद प्रकट करते हैं.
चित्रा 3 घूंट ढाल fractionations के लिए मिट्टी के नमूने incubations से परिणाम की उम्मीद है. ढाल भागों की दोनों 12 सी - शर्करा में संशोधन (A) मिट्टी और 13 सी ग्लूकोज मिट्टी संशोधन (सी) से Aliquots 1% agarose जैल पर चलाए जा रहे थे और एक सीढ़ी 1-केबी तुलना के लिए शामिल है . इन नमूनों में से प्रत्येक के लिए इसी DGGE उँगलियों के निशान (बी) में दिखाए जाते हैं और (डी). भिन्न के फिंगरप्रिंटिंग 13 सी ग्लूकोज 5-8 (डी) भागों में संशोधन नमूना में विशेष रूप से जीवाणु taxa का संवर्धन पता चलता है.
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Discussion
स्थिर आइसोटोप जांच प्रयोगों के उचित डिजाइन पृष्ठभूमि unlabelled समुदाय के ऊपर लेबल डीएनए प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. ऊष्मायन बार, सब्सट्रेट सांद्रता, ऊष्मायन स्थितियों (जैसे पोषक तत्वों, मिट्टी की नमी सामग्री), पार खिला और प्रतिकृति नमूना संबंधित विचारणीय बातें कहीं 10,18 चर्चा की गई है और हम अनुशंसा करते हैं कि पाठक इन प्रकाशनों से परामर्श करें जब एक घूंट ऊष्मायन डिजाइन हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल करने के लिए संबंधित, यह अतिरिक्त घूंट gradients से डेटा की व्याख्या से संबंधित विचार पर टिप्पणी के लायक है. Ultracentrifugation प्रक्रिया की प्रकृति के कारण, यह अतिरिक्त शुद्ध संस्कृतियों और देशी सब्सट्रेट incubated नमूनों जैसे नियंत्रण को शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें कि बैंड दिखने या विशेष भिन्न में गायब ही प्रोटोकॉल की कलाकृतियों नहीं हैं महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, ultracentrifuge एक ढाल के भीतर डीएनए एक agarose जेल (2A चित्रा) में दिखाई नहीं हो, लेकिन अभी भी ढाल (चित्रा 2B) की पूरी लंबाई को दूषित कर सकते हैं हो सकता है. हालांकि एम. capsulatus पैटर्न 2B चित्र में दिखाया जेल के घने भिन्न (5-7) में सबसे अलग कर रहे हैं, वही DGGE पैटर्न अभी भी lightest अंश (12) में मनाया गया . ध्यान से विचार नियंत्रण के साथ, घूंट ढाल अंश डेटा की व्याख्या संभव है.
कुछ अच्छी तरह से डिजाइन घूंट प्रयोगों (उदाहरण के निकट सीटू सब्सट्रेट सांद्रता कम ऊष्मायन समय में) की प्रकृति के कारण, आइसोटोप समावेश बहुत कम हो 10 कर सकते हैं . इसके अलावा, स्थलीय या जलीय वातावरण में सबसे सूक्ष्मजीवों प्रयोगशाला में वृद्धि की तुलना में लंबे समय पीढ़ी समय है, और विस्तारित ऊष्मायन बार समस्थानिक संवर्धन के detectable स्तर तक पहुँचने के लिए आवश्यकता होती है. अन्य आबादी substrates के एक किस्म metabolizing की सक्षम हो सकते हैं, और पूरी तरह से विकसित नहीं हो सकता है लेबल सब्सट्रेट पर. वहाँ भी कर रहे हैं समुदायों कि कम बायोमास के स्तर के साथ जुड़ा हो सकता है और निकाले न्यूक्लिक एसिड की कम पैदावार उत्पन्न (जैसे भूजल) हैं. इन मामलों के सभी में, लेबल nucleic एसिड की मात्रात्मक पुनर्प्राप्ति चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, प्राकृतिक और सिंथेटिक वाहक अणुओं की एक किस्म मौजूद है कि वर्षा और CSCL gradients से डीएनए की वसूली में सहायता. कैरियर अणुओं ग्लाइकोजन या एक archaeal 19 जीव, या रैखिक polyacrylamide जैसे प्रकृति, में सिंथेटिक से डीएनए जैसे मूल में जैविक जा सकता है. वाहक जैसे कि इन अणुओं का उपयोग कर जब डीएनए घूंट प्रदर्शन के लाभ यह है कि वे है कि आम तौर पर दिखाई नहीं हो सकता है और कम डीएनए सांद्रता के मात्रात्मक वसूली सुनिश्चित करने के CSCL gradients में बैंड के दृश्य सक्षम कर सकते हैं. CSCL gradients से डीएनए के कम nanogram मात्रा में सफल वसूली वास्तव में एक वाहक अणु 1,12 का उपयोग की आवश्यकता है . हाल के शोध से संकेत दिया है कि जैविक स्रोतों से प्राप्त वाहक अणुओं अक्सर स्रोत जीव 12 से डीएनए के साथ कर सकते हैं दूषित हो और परिणाम बहुत मुश्किल के लिए 13 सी - लेबल डीएनए (नहीं दिखाया डेटा है) के साथ जुड़े पैटर्न से अलग कर रहे हैं. इसलिए यह सिफारिश की है कि रैखिक polyacrylamide जैसे सिंथेटिक वाहक अणुओं डीएनए घूंट के लिए इस्तेमाल किया जा. इसके अलावा, कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) के उपयोग के बहाव आणविक 13,14 विश्लेषण के लिए लेबल डीएनए के उच्च विश्वस्तता पैदावार उत्पन्न, हालांकि chimeras प्रवर्धन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है और बहाव आणविक 14 विश्लेषण में पाया जा सकता है.
डीएनए घूंट के सबसे शक्तिशाली अनुप्रयोगों है कि पूरी तरह से शोषण किया जा अभी तक metagenomic पुस्तकालय विश्लेषण के लिए सक्रिय समुदाय के सदस्यों से डीएनए के संभावित वसूली है. हमें उम्मीद है कि एंजाइम की खोज में प्रमुख अग्रिमों स्थिर आइसोटोप के एकीकरण विविध स्थलीय और जलीय वातावरण से मौजूदा metagenomic सर्वेक्षण में जांच से परिणाम होगा. प्रोटोकॉल यहाँ कल्पना इन खोज - आधारित अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के लेबल डीएनए का उत्पादन करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम सामरिक परियोजना और प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से डिस्कवरी JDN को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman Coulter Inc. | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
References
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