斑马鱼胚胎眼组织显微切割的

Summary

本文介绍的方法microdissect与视网膜色素上皮细胞附着，从一到三天受精胚胎斑马鱼视网膜。

Abstract

斑马鱼眼睛发育的模式，因为其快速流行的动物进行研究

Protocol

第1部分：显微切割前的筹备工作

1. 解决方案
   1. E3的中型^4（5毫米氯化钠，0.17 mM的氯化钾， _氯化钙 0.33毫米和0.33毫米_硫酸镁 ）。
   2. 林格氏液^1，5（116毫米氯化钠，氯化钾2.9毫米，1.8毫米氯化钙_2，5毫米HEPES，PH7.2），过滤消毒。
   3. 5N氢氧化钠。
2. 化学蚀刻钨针
   1. 安全小烧杯中，在培养皿中含有粘土5N氢氧化钠。
   2. 将一侧的烧杯上的回形针，因此它与NaOH溶液接触。
   3. 将回形针和正极了一小段的钨丝（〜2CM）的一端从直流电源的负极。
   4. 裹的钨丝的另一端与一个小的粘土球，并为此动用的NaOH溶液。
   5. 增加电压约为3V，DIP线和NaOH溶液中，直到一个良好的蚀刻率达到。蚀刻针质量好，通常可以在10分钟内。
   6. 钨丝暴露的解决方案将成为逐步更薄。当粘土球脱落，另一端仍连接到正极线将有一个尖锐的针状。
   7. 冲洗用锋利的针，林格液或E3删除盐矿床。
   8. 将针由磁带的木制或持针器，易于处理。
3. 培养板
   1. “猎鹰”60 × 15毫米聚苯乙烯培养皿准备使用视网膜显微切割。
   2. 对于解剖的RPE附加视网膜，彻底粉碎两个胚胎在林格氏液摆脱前30分钟清扫表面的粘附性文化板。不久之前清扫，广泛接触新鲜林格氏液洗板。
4. 胚胎收集和分期
   1. 成年斑马鱼是保持为^4，5。
   2. 静态繁殖坦克独立分频器成对的亲鱼配种前的晚上。
   3. 取出后在第二天早上打开房间的灯是分压器。允许家长交叉每隔半小时每10分钟一班。独立后，每个过路的鱼。
   4. 从各个口岸在E3媒介收集胚胎分别保持在28 ° C。
   5. 阶段的胚胎，在10至12小时受精后（HPF）和restage立即清扫前，在特定时间点，根据既定的^准则1，6 。

第2部分：夹层-去除脑部和眼睛接触¹

• 本节中所述的程序共同解剖视网膜（第3A）和视网膜色素上皮附加视网膜（3B）。
• 所有的精细解剖杜蒙钳尖端和定位组织的另一杜蒙钳对协助。更精细的操作，如有必要，可用于化学蚀刻钨针。
• 所有的精细解剖〜5 - 8X奥林巴斯SZX16 1X的目标或相当于配备显微镜的放大下进行。
• 在E3培养基中的胚胎保持在一条长凳上孵化器在28 ° C旁边的显微镜容易胚胎访问期间清扫。
• 显微镜阶段由热板加热至28 ° C，以尽量减少温度的波动对基因表达的影响。

1. 在一个特定的发育阶段的胚胎转移林格猎鹰60 × 15毫米培养板中的解决方案，准备在1＃3部分描述。
2. 迅速切断的头部与躯干前部的一部分从身体。
3. 培养板引脚与协助钳这个组织后结束。
4. 打开背方从额头前开始的头。
5. 移除大脑，使眼睛的内侧暴露，并面临进一步操作上升。

第3A：视网膜清扫¹

1. 准备在第2部分所述的胚胎。
2. 小心地刷上面临镊子的尖端向上，直到看到一个小型开放的视网膜眼球内侧裸露的视网膜色素上皮。
3. 继续刷牙和脱皮的行动，直至视网膜内侧几乎全部暴露。避免刮伤和冲压暴露视网膜。
4. 要删除横向视网膜色素上皮视网膜，这是现在朝下，方法，刷文化板面约45 °角。
5. 删除是连接相对牢牢钉住的视网膜色素上皮的分离部分到C锯齿缘视网膜色素上皮ulture板夹层，然后轻轻地抬起视网膜。
6. 培养皿的底部滚上视网膜清理残留的RPE。
   1. 我们注意到，这个特殊的猎鹰聚苯乙烯培养板约20分钟的视网膜色素上皮的优惠坚持，一旦胚胎被击碎。这个属性是用来清除视网膜色素上皮残余。然而，视网膜细胞的坚持程度较轻，可高放大倍率的密切合作下视察的表面。一是罢工的RPE细胞去除和视网膜完整的完整性之间的平衡。
   2. 镜头往往坚持培养板，在轧制过程中，从视网膜分离。偶尔，它是必要的蚀刻钨针分离镜头与镜片表面上纷飞的行动。
7. 这些程序，可以成功地删除从视网膜视网膜色素上皮，不影响组织的完整性。这是由良好的整体形态（图1B和B'）和组织学（图1B“），尤其是箭头，保护之间的感光层和视网膜色素上皮细胞外基质是特别好（图1B。”;从整个胚胎（图1A“））与组织学比较。

第3B：视网膜色素上皮附加视网膜剥离³

1. 准备在第2部分所述的胚胎。
2. 培养板，由助理钳脚的头。从外侧边轻轻地抬起眼睛，和前侧滚。
   1. 推定脉络膜和RPE层外巩膜组织连接比较紧密，对皮肤和大部分可以去皮滚动的眼睛仔细的前侧。
3. 侧方暴露的眼睛，当眼睛仍然附着在皮肤上后，钨针取出镜头。
4. 这些程序可以成功地保护整个视网膜RPE层。推定脉络膜和巩膜组织大体上可拆除（图1C，C“和C”）。

第4部分：组织的RNA工作的样品收集

1. 解剖样品可以收集下游RNA的特性无RNase离心管¹日前在TRIZOL。

代表性的成果

图1（一）横向（一）52 HPF前清扫了斑马鱼幼虫头部背面观。 （A“），相应的幼虫头部的组织切片（A）及（一）（二）横向和（B'），在54 HPF解剖视网膜背视图。视网膜表面是完整的两个横向背的意见（二）相应的病理解剖视网膜节（b）及（B“）。视网膜和视网膜层压结构完整。特别是细胞外基质之间的感光层和RPE（一“，箭头），保存完好，在解剖视网膜（B”箭头）。 （三）横向（C“）52 HPF的视网膜色素上皮附着在视网膜的一个解剖内侧。 RPE层是完整的和连续，这也是由病理解剖组织的第（三）表示。“C”的白色区域是视神经（箭头），组织学，组织标本在4％，收集和固定多聚甲醛塑料包埋和切片对这些样品进行了描述^。比例尺= 50微米。

Discussion

斑马鱼眼组织显微切割可以有效地获得完整的视网膜和视网膜色素上皮附加视网膜。这大大助攻表达的研究，涉及到一个特定的眼组织（即视网膜色素上皮）。事实上，我们已经成功地利用这些程序获得整个视网膜和视网膜色素^上皮 3 RNA的表达谱。这些配置文件的实用工具，是我们最近的途径和基因家族在视网膜^分化突变2扰动识别，大力支持。在视网膜的解剖程序的最关键步骤是尖的镊子和组织为视网膜色素上皮残余物去除滚动的刷牙动作。我们发现，可调整的手臂肘部在于在清扫过程中的椅子可以大大稳定不必要的手部动作。此外，一些视网膜色素上皮残余可能会留在锯齿缘。这是因为本地区不能坚持培养板剥离面接触。尽管如此，大多数视网膜色素上皮细胞被破坏在刷牙和剥离行动，这些色素上皮残余不可能是完整的。另外，必须平衡之间的视网膜完整的视网膜色素上皮去除的完整性。对于解剖的RPE附加视网膜，大部分推定脉络膜和巩膜组织，看上去就像一个薄薄的透明膜，可揭下连同皮肤。它也可能以消除这些残余物表面涂刷组织，但是平衡两者之间的视网膜色素上皮的完整性和污染的组织切除的完整性。我们已经成功地进行解剖1-3 DPF（24-72 HPF），其中包括⁷斑马鱼眼的形态发生的关键阶段。平均，它会采取头撞断的解剖组织收集大约10到20分钟。通过实践，学生可以在一个月内执行一个很好的和一致的夹层。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cordless pestle motor	VWR international	47747-370
DC power supply	Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)	VWR international	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox	Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm	BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope	Olympus Corporation	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone	Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate	Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL	Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
Wooden Applicator	Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.