הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

Abstract

החשיבות של שימוש תאים ראשוניים, במקום שורות תאים סרטניים, ללימודים ביולוגיים הופך להכרה רחבה. תאים ראשוניים הם העדיפו במחקרים אפופטוזיס של מחזור התא, שליטה, תיקון דנ"א, כמו תאים סרטניים לשאת מוטציות בגנים המעורבים בתהליכים אלה. תאים ראשוניים לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן, בשל תחילת ההזדקנות replicative או aneuploidization. לפיכך, תרבויות חדשות צריכים להיות הוקמה על בסיס קבוע. ההליך עבור בידוד של fibroblasts מכרסם עובריים היא מבוססת היטב, אבל בידוד תרבויות פיברובלסטים מבוגרים לעתים קרובות אתגר. Fibroblasts מכרסם למבוגרים מבודדים מודלים העכבר של מחלות אנושיות יכולה להיות מלאה המועדפת כאשר משווים אותם fibroblasts מחולים האדם. יתר על כן, fibroblasts מבוגר הם חומר זמין רק כאשר עובדים עם מכרסמים בר שבו נשים בהריון לא ניתן להשיג בקלות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד והתרבות של fibroblasts מבוגר מהעור מכרסם והריאות. השתמשנו בהצלחה הליך זה לבודד fibroblasts מתוך למעלה מעשרים מינים מכרסם מעכברים וחולדות מעבדה כדי מכרסמים בר כגון בונה, קיפוד, והסנאי.

Protocol

1. לפני שמתחילים

1. לעקר מספריים מלקחיים עם אתנול 70%.
2. המקום stirrer מגנטי קטן בתוך כוס 30 מ"ל, מכסים עם שתי שכבות של נייר, ועל החיטוי.
3. הכן 28 יחידות וונש / mL מניות פתרון של Liberase Blendzyme 3 במים סטריליים. בצע 0.5 aliquots מ"ל ולהקפיא ב -20 ° C. הפשרה aliquot חדש לפני כל שימוש. הפתרון עשוי להופיע מעונן לאחר ההפשרה. וורטקס הפתרון עד שיתברר.
4. לחמם את תרבות התקשורת הסלולרי.

2. דוגמה חיה הכנה

זהירות: חיות בר עלולים להכיל פתוגנים כגון וירוס הכלבת. תמיד להיות מודעים לפתוח החדים.

1. להרדימו והמקום פגר ב 4 ° C. עדיף להשתמש פגר מיד, אולם אם הדבר אינו מעשי כגון אם בעלי החיים שנאספו בשטח, פגרי ניתן להשתמש תוך 24 שעות. לאחר 24 שעות התשואה יורדת התא.
2. מנתחים את החיה בסוויטה כירורגית או במנדף כימי (לא מכסה המנוע בתרבית רקמה).
3. אזור בית השחי הוא אתר נוח לאסוף דגימות עור כמו עור בבית השחי הוא רזה, מכיל פחות שומן, פרווה הוא פחות צפוף. נקו את האתר החתך עם אתנול 70%. ודא פרווה ספוגה אתנול.
4. לגלח את הפרווה סביב האתר חתך באזמל חד. לגלח שטח גדול יותר מאשר באתר החתך הרצוי. נסו לצמצם חתכים בעור. ריסוס באזור עם אתנול 70% ולתת לו להתייבש.
5. כדי לאסוף דגימת עור בלו שבר כ 1 ² ס"מ. לצבוט את העור עם מלקחיים רקמות, לגזור במספריים. נסו לא לחתוך את שכבת השומן בעור, כמו שומן מפריעה לעיכול collagenase. כדי לאסוף את דגימות ריאה, לשטוף את אזור החזה עם 70% אתנול, ולפתוח את העור על החזה במספריים על ידי ביצוע חתך T-צורתו ומשך לגזרים את דשי של העור. לשטוף את האזור שריר פתחה עם אתנול 70% ולתת להתייבש. חותכים את החזה באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים (חותכי להשתמש עצם לבעלי חיים גדולים יותר). השתמש בטכניקות סטרילי כדי למנוע זיהום האיברים הפנימיים. אל תיגע באיברים פנימיים עם מכשירים נגע פרווה של בעלי חיים. גזור שברי הריאות של כ 1 ס"מ ² באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים.
6. רקמה שברי מקום 50 צינורות מ"ל עם PBS סטרילי כדי למנוע התייבשות.
7. לשטוף החיצוני של 50 מ"ל עם שברי צינורות רקמה עם אתנול, ולקחת אותם אל מכסה המנוע בתרבית רקמה.
8. כראוי תשליך הפגר החי.

3. מחלץ תאים

1. מעבירים את שברי רקמה לתוך צלחת 10 ס"מ תרבות רקמות באמצעות אזמל סטרילי. אין להעביר PBS יותר מדי עם המדגם.
2. חותכים את הרקמה אל ~ 1 מ"מ חלקים באמצעות שני ניתוחים. שימוש שני להבים באמצעות פעולה מספריים החל ממרכז ומושך מזה. שמור את הרקמה כידר, לא לחתוך חתיכה אחר חתיכה. כאשר חותכים את העור די דומה מרק, זה לא יהיה להפריד לחתיכות אבל יהיה למתוח דק. רקמת הריאה קל לחתוך, וזה יהיה להפריד לחתיכות קטנות.
3. באמצעות אזמל, העברת רקמות וחותכים כוס 30 מ"ל סטרילי עם בר ומערבבים סטרילית. לשטוף את הצלחת המשמש לחיתוך רקמות עם 10 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם 0.14 יחידות וונש / mL Liberase Blendzyme 3, 1X אנטיביוטי / antimycotic, ולהוסיף הפתרון כוס 30 מ"ל עם שברי הרקמה.
4. מכסים את הכוס בנייר כסף סטרילי, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, תוך בחישה לאט לאט, במשך 30 עד 90 דקות. משך הדגירה תלוי בסוג מינים הרקמה. הקפד לא מעל לעכל את הרקמה. Best התשואות מתקבלים כאשר שברי הרקמה עדיין קיימות בסוף העיכול. העור לוקח זמן רב יותר לעיכול מאשר הריאה. העור מפני בעלי חיים גדולים לוקח יותר זמן לעכל. בדוק את מערכת העיכול לאחר 30 דקות, ולאחר מכן כל 10 דקות. כאשר העור והעיכול יושלם, התקשורת הופכת להיות מעונן ושברי העור נפרדים זה מזה, ואת הקצוות של החלקים להיות "מעורפל". עיכול ריאות יש להפסיק כאשר שברי ריאות לשנות צבע אדום לבן ולהתחיל להרכיב סיבים דביק.
5. הפתרון Pipet המכיל שברי הרקמה הלוך ושוב כדי לשבור את הגושים. העברת הפתרון שפופרת 50 מ"ל סטרילי. אם השברים לעבור בקלות דרך קיצוץ 10 מ"ל פיפטה והעיכול נעשה היטב. שוטפים את כוס 3 פעמים עם 10 מ"ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic ולהוסיף את התקשורת הצינור 50 מ"ל עם שברי הרקמה. סגור את שפופרת 50 מ"ל ומערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. FBS בתקשורת יפסיק Liberase העיכול.
6. ספין ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. הסר את supernatant. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic. Pipet ההשעיה עםכוח מרבי לשבור את פיסות רקמה.
7. הוסף עוד 30 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic, מערבבים צנטריפוגות ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. חזור פעם נוספת כדי להסיר את עקבות Liberase.
8. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם FBS 15%, 1X אנטיביוטי / antimycotic והעברה צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות ומניחים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, 3% O ₂ .
9. בדוק את צלחות כל יום במשך fibroblasts וצבע התקשורת. אם הבידוד היה מוצלח, fibroblasts לזחול מתוך שברי רקמות לצרף צלחת (איור 1). פיברובלסטים מתחילים לצאת שברי הרקמה תוך 2-5 ימים.
10. אם צבע השינויים התקשורת צהובה, זה מצביע על אפשרות של זיהום או הצפיפות של תאים. בדוק את הצלחות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה גבוהה. אם חיידקים, פטריות, או תולעים נמצאים להשליך את הלוחות (זה רק לעתים נדירות בעיה עם חיות מעבדה, אך עלולה להתרחש כאשר הדגימות שנאספו בטבע). אם הזיהום לא קיים, אבל התקשורת שינה את צבעו, זו נגרמת על ידי או יותר מדי תאים או רקמות שברים רבים מדי להציב צלחת זהה. אם יותר מ 60% של צלחת מכוסה על ידי fibroblasts המצורף, לשנות את התקשורת על הצלחת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה. אם לא fibroblasts רבים מחוברים לצלחת, לשנות את התקשורת לפצל את פיסות הרקמה ל 2-4 צלחות.
11. לאחר 7 ימים, אם התקשורת לא שונו קודם לכן, לשנות את התקשורת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה.
12. דגירה ושברי תאים ורקמות עבור 7 ימים נוספים. ביום 14 כל fibroblasts קיימא יש יצאו שברי הרקמה.
13. לאחר 14 ימים מתחילת בידוד התא, להשליך את התקשורת הישנה ושברי רקמות, לקצור את התאים צלחת אותם על צלחת חדשה 5x10 ⁵ תאים / EMEM צלחת עם FBS 15%, 1X פניצילין / סטרפטומיצין, ללא חומצות האמינו החיוניות , נתרן pyruvate. התקשורת EMEM יתמכו בצמיחה של fibroblasts סוגי תאים בלבד ושאר ימות או להפסיק מתרבים.
14. לאחר שהתאים מגיעים מפגש 80-90%, להקפיא aliquot של תאים לשימוש עתידי.
15. המשך culturing התאים על ידי פיצול אותם 5x10 ⁵ תאים / צלחת כאשר התאים מגיעים מפגש 80-90%.

4. נציג תוצאות

Fibroblasts רגיל הם תאים גדולים עם בליטות בולט (lamellipodia) (איור 2). Fibroblasts לגדול בשכבה. תרבות גדל בריא מכיל תאים 1-10% בשלב M, מוכר מעוגל למעלה כמו תאים מוגבה מעל פני השטח של הצלחת, אך לא מנותקת מן הצלחת (איור 3). בדרך כלל, צלחת 10 ס"מ seeded עם ⁵ תאים 5x10 הופך ומחוברות בימים 3-4. זמן ההכפלה משתנה מאוד בין המינים, והיא עלולה להיות גדולה יותר עבור כמה מינים חיים ארוכים מכרסם ^1. כאשר תאים למלא צלחת עוצרים התפשטות בשלב G1. צלחת ומחוברות אופיינית של fibroblasts מכיל שכבה של תאים צפופים (איור 4). כאשר התאים מגיעים מפגש 90% הם מוכנים פיצול. אם תרצה, התאים יכול להישמר על צלחת ומחוברות נעצר לפרקי זמן קבוע עם שינויים המדיה (פעם או פעמיים בשבוע).

באיור 1. בידוד פיברובלסטים מהעור העכבר (א) ו - ריאה (B). התקשורת שונתה כדי להסיר תאים פנויים ופסולת לפני לקיחת תמונות ביום 7.

איור 2. ריאה עכבר fibroblasts.

איור 3. שדה של fibroblasts העכבר המכיל תאים בשלב-M, צילם בהגדלה של 10X.

איור 4. צלחת ומחוברות של fibroblasts העכבר, צילם בהגדלה של 10X.

Discussion

Fibroblasts העיקרי רגיל לספק חלופה מצוינת הוקמה שורות תאים סרטניים מחקר ביולוגי. יתרון חשוב של fibroblasts היא שהם אינם נושאים מוטציות אונקוגנים ו מדכאי הגידול במחזור לשמור על שלמות התא מחסומים. זה עושה fibroblasts נורמלי מערכת המועדפת עבור המחקרים של ויסות מחזור התא, תיקון DNA, אפופטוזיס. פרוטוקול המתואר כאן מציע מתכון פשוט עבור בידוד ותחזוקה של fibroblasts העיקרי. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבודד fibroblasts מעל 20 מינים של מכרסמים.

חשוב לשמור על סטריליות בכל עת כאשר עובדים עם תרביות תאים, כדי למנוע זיהום. אם המעבדה גם תרביות תאים סרטניים קווים אגרסיביים כגון תאים הלה, fibroblasts יש לטפל בנפרד תאים סרטניים. הוא העדיף להיות מכסה המנוע המיועד מדגרה תרבויות העיקרי.

עדיף לשמור על תרביות תאים העיקרי בריכוז החמצן הפיזיולוגי של 3%. האטמוספירה (20%) החמצן מקצרת את תוחלת החיים של תרבויות ומגבירה סטרס חמצוני. Fibroblasts עכבר רגישים סטרס חמצוני ויהיה להזדקן או להיכנס למשבר בתוך ~ 14 הכפלות האוכלוסייה כאשר שמר על% 20 (אטמוספרי) חמצן. Fibroblasts עכבר יכול להישמר לנצח ב ² חמצן 3%.

תמיד לשמור תיעוד של מספר הכפלת אוכלוסיית התרבויות. מינים גדולים (מסת גוף מעל 8,000 גרם) צפויים להציג הזדקנות replicative, ויהיה יש תוחלת חיים מוגבלת בתרבית, אפילו חמצן 3% ^1. תאים ממינים קטנים יותר, כגון עכברים וחולדות, יתרבו ללא הגבלת זמן בכל חמצן 3%, אך הוא עשוי בסופו של דבר להפוך aneuploid. במידת האפשר, להתחיל את הניסויים באמצעות תאים על הכפלת האוכלוסייה נמוכה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 media	Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic	Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media	ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel	Multiple suppliers
Three Gas Control incubator	Forma or Heraeus