RNA转录受到广泛的是由众多的反式作用的RNA结合蛋白(限制性商业惯例)介导的转录后调控。在这里,我们提出了一个普及的方法,准确地确定和一个转录大规模RNA结合位点的限制性商业惯例。
通过数百个RNA结合蛋白(限制性商业惯例)和microRNA往往是在一个细胞类型依赖性表达的核蛋白复合物(miRNPs)。的相互作用,RNA转录,转录后基因调控要了解这些RNA结合因素的相互作用影响个人成绩单,在体内蛋白质的RNA的相互作用是必要的1的高分辨率地图的监管。
遗传,生化和计算方法相结合的典型应用,识别RNA – RBP的或RNA – RNP的相互作用。芯片分析immunopurified限制性商业惯例的RNA(RIP – Chip)的定义在转录水平的目标,但其应用受到限制的表征动力学稳定的相互作用和3,4只在极少数情况下可以识别的限制性商业惯例的识别元素( RRE )内的长期目标RNA。更直接的RBP的目标网站的信息是通过在体内的紫外光交联的交联的RNA片段和基因测序(CLIP)10隔离与免疫 7-9 5,6结合。剪辑是用来识别一个限制性商业惯例的11-17的目标。然而,剪辑是有限的紫外线254纳米RNA -蛋白质交联效率低,交联的位置是不容易识别的内交联的序列片段,使其难以从背景中分离非交联紫外光交联的靶RNA片段RNA片段也存在于样品中。
我们制定了一个强大的细胞为基础的交联的方法,以确定在高分辨率和转录的全细胞限制性商业惯例和miRNPs的结合位点,我们长期的PAR -剪辑(Photoactivatable -核苷增强的交联和免疫)(见大纲图1a的方法)。该方法通过活细胞的光反应的核苷类似物,如4 – thiouridine(4 – SU)和6 thioguanosine(6 – SG),纳入到新生RNA转录依赖。 365纳米的紫外线光照射诱导细胞光反应核苷标记细胞的RNA相互作用的限制性商业惯例的有效交联。其次是隔离交联和coimmunoprecipitated RNA免疫沉淀的限制性商业惯例的利益。分离出的RNA转换成cDNA文库和使用深测序公司Solexa技术。 PAR剪辑编写的cDNA文库的一个特点是,可以由居住在序列的cDNA突变确定的交联的精确位置。当使用4 -苏交联序列胸苷胞苷过渡,而使用6 – SG的鸟苷腺苷基因突变的结果。交联序列的突变,使人们有可能分开他们从丰富的细胞分子RNA的序列的背景。
据报道方法应用到一个多样化的RNA结合蛋白的数量在哈夫纳等 18
The authors have nothing to disclose.
我们感谢有益的讨论Tuschl实验室成员。氢是由德国学术Austauschdienst(DAAD)的支持。这项工作是支持由瑞士国家基金拨款#3100A0 – 114001锰锌; TT是霍华德休斯医学研究所研究员,并在他的实验室的工作是由美国国立卫生研究院拨款GM073047和MH08442和斯塔尔基金会的支持。
Buffers and reagents
Growth medium HEK293 cells
4-thiouridine stock solution (1 M)
Doxycyclin stock (10 mg/ml)
1x NP40 lysis buffer
Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.
Citrate-Phosphate buffer
IP-wash buffer
High-salt wash buffer
Dephosphorylation buffer
Phosphatase wash buffer
Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT
PNK buffer
SDS PAGE loading buffer
2x Proteinase K buffer