PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

Summary

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

Abstract

Transcrições de RNA são submetidos a pós-transcricional de regulação gênica, interagindo com centenas de RNA-proteínas de ligação (RBPs) e microRNA contendo complexos de ribonucleoproteínas (miRNPs) que muitas vezes são expressos em uma célula do tipo dependente. Para entender como a interação desses fatores RNA-binding afeta a regulação da transcrição individual, mapas de alta resolução de in vivo da proteína-RNA interações são necessárias ^1.

Uma combinação de fatores genéticos, bioquímicos e abordagens computacionais são tipicamente aplicados para identificar RNA-RBP ou RNA-RNP interações. Microarray perfis de RNAs associados RBPs immunopurified (RIP-Chip) ² define metas em nível de transcriptoma, mas sua aplicação é limitada para a caracterização das interações cineticamente estável e somente em casos raros ^3,4 permite identificar o elemento de reconhecimento de RBP (RRE ) dentro do RNA alvo de comprimento. Mais direta RBP informações do site-alvo é obtido através da combinação in vivo crosslinking UV ^5,6 imunoprecipitação com ^7-9 seguido pelo isolamento de segmentos de RNA reticulado e seqüenciamento de cDNA (CLIP) ^10. CLIP foi usado para identificar alvos de uma série de RBPs ^11-17. No entanto, CLIP é limitada pela baixa eficiência de UV 254 nm crosslinking RNA-proteína, e da localização do crosslink não é facilmente identificável dentro dos fragmentos seqüenciados reticulado, o que torna difícil separar segmentos de UV-reticulado RNA alvo de fundo não-reticulado RNA também fragmentos presentes na amostra.

Nós desenvolvemos uma abordagem crosslinking poderosa baseada em células para determinar em alta resolução e transcriptoma-wide os sítios de ligação de celular e RBPs miRNPs que chamamos de PAR-Clip (Photoactivatable-ribonucleosídeo-Enhanced Crosslinking e imunoprecipitação) (ver fig. 1A para um esboço do método). O método baseia-se na incorporação de análogos de ribonucleosídeo fotorreativas, tais como 4-Tiouridina (4-SU) e 6-thioguanosine (6-SG) em transcrições de RNA nascente por células vivas. Irradiação das células pela luz UV de 365 nm induz crosslinking eficiente de fotorreativas nucleosídeos marcado RNAs celulares para RBPs interagindo. Imunoprecipitação da RBP de interesse é seguido pelo isolamento do RNA reticulado e coimmunoprecipitated. O RNA isolado é convertida em uma biblioteca de cDNA e profundo seqüenciado usando a tecnologia Solexa. Um traço característico de bibliotecas de cDNA preparados por PAR-Clip é que a posição precisa de reticulação podem ser identificados por mutações que residem no cDNA seqüenciado. Ao usar 4-SU, timidina seqüências reticulado para a transição da citidina, enquanto usando 6-SG resulta em guanosina à adenosina mutações. A presença das mutações em seqüências reticulado torna possível separá-las do fundo de seqüências derivadas de abundantes RNAs celulares.

Aplicação do método a um número de diversas proteínas de ligação RNA foi relatada em Hafner et al. ¹⁸

Protocol

O protocolo a seguir descreve o procedimento PAR-clip para HEK293 células que expressam FLAG / HA-tagged IGF2BP1 após indução com doxiciclina. Vamos usar um anticorpo anti-FLAG para imunoprecipitação.

PAR-Clip irá funcionar com qualquer linha de células expressando níveis detectáveis ​​do endógeno, untagged RNA binding protein (RBP) de juros, se um anticorpo eficiente para imunoprecipitação está disponível.

Células expansão

1. Expandir FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 células em meio de crescimento. Recomendamos o uso de entre 100-400 x 10 ⁶ células (aprox. 10-40 15 centímetros placas de cultura de células) como ponto de partida. Cultivá-las a aproximadamente 80% confluência.
2. 14 h antes de adicionar um crosslinking) 4 Tiouridina a uma concentração final de 100 mM (1:1000 v / v de um M-1 4 Tiouridina solução estoque) diretamente para o meio de cultura celular e b) induzir a expressão do FLAG / HA tagged IGF2BP1 pela adição de 1 mg / ml de doxiciclina (1:10.000 v / v da solução estoque 10 mg / ml doxiciclina). NOTA: em vez de 4-Tiouridina você também pode usar 100 mM de 6 thioguanosine.

UV-Crosslinking

1. Lave as células uma vez com 10 ml gelada PBS por placa e remover completamente PBS.
2. Placas lugar em uma bandeja com gelo e irradiar descoberto com 0,15 J / cm ² de 365 nm de luz UV em um Stratalinker 2400 (Stratagene) ou dispositivo similar.
3. Raspe as células com um policial de borracha em 1 ml de PBS por transferência de placas, para 50 tubos de centrifugação ml e recolher por centrifugação a 500 xg por 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. 100 x 10 ⁶ células HEK293 (10 15 pratos cm) vai render aprox. 1 ml de pellet celular molhado.
4. (Opcional) menos que você queira continuar diretamente com a lise celular, choque congelar o pellet celular em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Pellets de células podem ser armazenadas por pelo menos 12 meses.

Lise celular e RNaseT1 digest

1. Tome-se pellet celular de células reticuladas em 3 volumes de 1x tampão de lise NP40 e incubar no gelo por 10 min.
2. Lisado de células claras por centrifugação a 13.000 xg por 15 min a 4 ° C.
3. Limpar o lisado ainda filtrando-a através de uma membrana de 0,2 mm seringa filtro (Acrodisc Pall ou equivalente).
4. Adicionar RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / mL) para uma concentração final de C. ° 1 U / mL e incubar em banho-maria por 15 min a 22 Reação fria posteriormente por 5 min no gelo antes de prosseguir.

Imunoprecipitação e recuperação de fragmentos de RNA alvo reticulado

Usando o separador magnético

Siga estas orientações ao longo da preparação da amostra para evitar a esferas magnéticas de secar.

1. Coloque o tubo que contém as contas sobre o suporte magnético para 1 2 minutos.
2. Adicione o buffer para o tubo enquanto que o tubo está no separador magnético.
3. Tampe o tubo, remova-o do separador magnético, e ressuspender as esferas. Você pode voltar a suspender as contas sacudindo o tubo com o dedo ou usar um vortexer fixado em 5 6.
4. Centrifugar brevemente para coletar todas as pérolas que podem permanecer na tampa do tubo.
5. Repita os passos 1 a 4, conforme necessário.

Preparação de esferas magnéticas

1. Transferência de 10 ml de partículas de proteínas Dynabeads G magnética (Invitrogen) por lisado celular ml (para uma experiência típica que deve ser aprox. 40 50 ul de contas) para um microtubo de 1,5 ml. Lavar contas duas vezes com 1 ml de tampão citrato-fosfato.
2. Ressuspender em duas vezes o volume de tampão citrato-fosfato em relação ao volume original de suspensão de esferas.
3. Adicionar 0,25 mg de anticorpo anti-FLAG M2 monoclonal (Sigma) por ml de suspensão e incubar em uma roda giratória por 40 min em temperatura ambiente.
4. Lavar contas duas vezes em 1 ml de tampão citrato-fosfato para remover anticorpos não ligados.
5. Ressuspender contas em duas vezes o volume de tampão citrato-fosfato em relação ao volume original de suspensão de esferas.

Imunoprecipitação (IP), segundo a digestão RNase T1 e desfosforilação

1. Adicionar 20 l de recém-preparados anticorpos conjugados esferas magnéticas por ml de RNase T1 parcial lisado celular tratados e incubar em 15 tubos de centrifugação ml em uma roda giratória por 1 hora a 4 ° C.
2. Colete esferas magnéticas em um coletor de partículas magnéticas para 15 e 50 tubos de centrifugação ml (Invitrogen) e transferir para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
3. Lavar contas 3 vezes em 1 ml de tampão de lavagem IP.
4. Adicionar RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / mL) a uma concentração final de 100 U / mL e incubar a suspensão de esferas em banho-maria por 15 min a 22 ° C. Legal posteriormente no gelopor 5 min.
5. Lavar contas 3 vezes em 1 ml de alto-sal tampão de lavagem.
6. Contas ressuspender em 1 volume de tampão desfosforilação
7. Adicionar fosfatase alcalina intestinal bezerro (CIAP, NEB) para uma concentração final de 0,5 U / mL, e incubar a suspensão por 10 min a 37 ° C.
8. Lavar contas duas vezes em 1 ml de fosfatase tampão de lavagem
9. Lavar contas duas vezes em polinucleotídeo quinase buffer (PNK) sem TDT (televisão digital terrestre a concentração necessária para a reação enzimática é alta o suficiente para danificar a esferas magnéticas).
10. Contas ressuspender em um volume original talão de PNK tampão

Radiomarcação dos segmentos de RNA reticulado às proteínas immunoprecipitated

1. À suspensão de esferas descrito acima, adicione ^Υ-32 P-ATP para uma concentração final de 0,5 PNK μCi / mL e T4 (NEB) a 1 U / mL em um volume original talão. Incubar a suspensão por 30 min a 37 ° C.
2. Adicionar não-radioativo ATP para obter uma concentração final de 100 mM e incubar por mais 5 minutos a 37 ° C.
3. Lavar a esferas magnéticas 5 vezes com 800 mL de tampão PNK sem DTT.
4. Volte a suspender as contas em 70 mL de SDS-PAGE tampão de carregamento.

SDS-PAGE e eletroeluição reticulado de RNA-proteína complexos de fatias de gel

1. Incubar a suspensão radiolabeled por 5 min em um bloco de aquecimento a 95 ° C para desnaturar e solte o RBP immunoprecipitated com RNA reticulado e vortex.
2. Remova a esferas magnéticas sobre o separador e transferir o sobrenadante para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Carga 40 mL do sobrenadante por poço de uma Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) em gel de poliacrilamida pré-moldados e executar o gel por 55 min em 200 V.
4. Desmonte a câmara de gel e desmantelar o gel, deixando-a montada em uma placa. Para facilitar o alinhamento do gel para a impressão em papel phosphorimager, recomendamos implantar três minúsculos pedaços gel radioativos assimetricamente menos três dos quatro cantos do gel. Peças gel radioativos podem ser coletados a partir de géis que foram anteriormente utilizadas para purificar radiolabeled oligonucleotídeos sintéticos. Embrulhe o gel em filme plástico (por exemplo, Saran wrap) para evitar a contaminação.
5. Expõe o gel a uma tela phosphorimager blanked para 1 h e visualizar em um phosphorimager.
6. Alinhar o gel na parte superior da impressão phosphorimager usando as peças gel implantado para orientação. Cortar as bandas que correspondem ao tamanho esperado de RBP (IGF2BP1, aprox. 75 kDa) e transferir para um D-Tube Midi dialisadores e adicionar 800 mL 1x tampão SDS execução.
7. Electroelute o reticulado RNA-RBP complexo em 1x SDS tampão de corrida a 100 V por 2 h. excisadas do gel e electroeluted em uma D-Tube de dialisadores Midi (Novagen) em 800 mL de buffer SDS execução de acordo com as instruções do fabricante.

Digestão por proteinase K

1. Adicionar um volume igual de tampão 2x proteinase K em relação ao electroeluate, seguido pela adição de proteinase K (Roche) para uma concentração final de 1,2 mg / ml. Incubar por 30 min a 55 ° C.
2. Recuperar o RNA por ácido fenol / clorofórmio / extração IAA (25:24:1, pH 4,0), seguido por uma extração de clorofórmio. Adicionar 1 ml de glicogênio (estoque 10 mg / ml) precipitar o RNA, adicionando 3 volumes de etanol. Dissolver o sedimento em 10,5 mL de água.

preparação biblioteca de cDNA e sequenciamento de profundidade

Levar o RNA recuperados através de um protocolo de preparação de cDNA da biblioteca padrão originalmente descrita para a clonagem de pequenos RNAs reguladores ^19. O primeiro passo, a ligadura 3 'adaptador, foi realizado como descrito em uma escala de 20 l utilizando 10,5 mL do RNA recuperado. Use o seqüenciamento Solexa adaptador conjuntos descritos. Dependendo da quantidade de RNA recuperado, 5'-adaptador-3'-adaptador produtos sem inserções podem ser detectados após a amplificação do cDNA como faixas adicionais PCR. Em tais casos, o produto mais impostos PCR de tamanho esperado de um NuSieve 3% de baixo ponto de fusão agarose gel, eluída do produto da PCR do gel peças usando o kit GelElute (Qiagen) e seqüência usando a tecnologia Solexa. Um Solexa seqüenciamento executar normalmente oferece, entre 6 e 10 milhões seqüência lê-se que são suficientes para uma cobertura ampla do transcriptoma sítios de ligação das proteínas RNA vinculativo.

Análise bioinformática

Análise bioinformática cuidadosa da seqüência lê precisa ser feito para obter insights significativos para os locais de ligação para o RNA RBP examinados, como o elemento de reconhecimento de RNA, as regiões preferenciais de ligação a RBP tem (exônico vs intrônicos, codificação seqüência vs não traduzidas seqüência). A seqüência lê precisam ser alinhados contra as bases de dados do genoma e EST. Nós usamos geralmente lê mapping exclusivamente ao genoma com até um desencontro de inserção ou exclusão de construir clusters de seqüência de leituras que podem então ser analisados. A freqüência de mutações características na seqüência cluster lê, T a transições C ao usar 4-SU e G para A transição quando utilizando 6-SG, são indicativos de seqüências de sucesso reticulado. Em nossa experiência RNAs uncrosslinked rotulados com 4-SU mostram uma taxa de mutação de fundo de cerca de 20%. Esta taxa é aumenta para aprox. 50-80% em cima de reticulação.

A descrição detalhada da análise bioinformática pode ser encontrado no material suplementar da publicação por Hafner et al. ¹⁸

Passos opcional

Determinação dos níveis de incorporação de 4-Tiouridina em RNA total

Isolar RNA total a partir da linha celular estável expressando a RBP de interesse depois de crescer em meio suplementado com 100 mM 4SU 16 h antes da colheita. Como controle, as células cultivadas sem adição de colheita 4SU. Isolar RNA total através da adição de 3 volumes de reagente Trizol (Sigma) para as pelotas de células lavadas seguindo as instruções do fabricante s. Além disso foi purificar RNA total usando Qiagen RNeasy acordo com o protocolo do fabricante. Para evitar oxidação da 4SU durante RNA isolamento e análise, adicionar 0,1 mM ditiotreitol (TDT) para os buffers de lavar e subseqüentes passos enzimáticos. Digerir e desfosforilada RNA total de nucleosídeos único para a análise de HPLC como descrito anteriormente ^20. Brevemente, em um volume de 30 mL, incubar 40 mg de RNA total foram purificados por 16 horas a 37 ° C com 0,4 U de fosfatase alcalina bacteriana (Worthington Bioquímica) e 0,09 veneno de cobra U fosfodiesterase (Worthington Bioquímica). Como padrão de referência, use um RNA sintético 4SU marcado, (nós standardly uso CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) e também submetê-lo para completar a digestão enzimática. Separar os misturas de ribonucleosídeos por HPLC em uma descoberta Supelco C18 (ligado partículas de sílica de fase M 5, 250 x 4,6 mm) coluna de fase reversa (Bellefonte PA, EUA). Buffers HPLC são 0,1 M TEAA em acetonitrila 3% (A) e acetonitrila 90% em água (B). Use um gradiente isocrático: 0 B% por 15 min, 0-10 B% por 20 min, 1-10 B% por 30 min. Aplicar a 5 min B 100% lavar aplicada entre corre para limpar a coluna de HPLC.

Resultados representante

Figura 1 (painel da direita) mostra um resultado representativo de um PAR-Clip realizado com linhagens de células expressando FLAG / HA-tagged IGF2BP1 com 4 e 6-SU-SG. Note-se que a eficiência de reticulação de 6-SG para IGF2BP1 é menor do que a eficiência de reticulação para 4-SU. A baixa eficiência de reticulação irá resultar em uma maior fundo de seqüências derivadas de fragmentos de RNAs celulares abundantes e, portanto, você deve considerar a expansão da experiência ao usar menos eficiente nucleosídeos fotorreativas.

O painel esquerdo da Figura 1 mostra uma comparação do uso de diferentes análogos uridina fotorreativas que poderia ser potencialmente usada para PAR-Clip em comparação com crosslinking nm tradicional UV 254.

A intensidade da banda radioativo do comprimento correto lhe dá uma boa idéia se o experimento PAR-Clip tem trabalhado e tem isolado RNA suficiente para realizar um pequeno RNA seqüenciamento protocolo (passo-a-passo para a preparação descrição biblioteca de cDNA de pequenas seqüenciamento RNAs podem ser encontrados em ^19). A freqüência de mutações características lê na seqüência, T a transições C ao usar 4-SU e G para A transição quando utilizando 6-SG, são indicativos de seqüências de sucesso reticulado. Em nossa experiência RNAs uncrosslinked rotulados com 4-SU mostram uma taxa de mutação de fundo de cerca de 20%. Esta taxa é aumenta para aprox. 50-80% em cima de reticulação.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells

DMEM 10% FBS 2 mM L-Glutamine 100 U/ml penicillin 100 U/ml streptomycin 100 μg/ml hygromycin 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)

260.27 mg 4-thiouridine 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)

10 mg doxycyclin 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.

50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0.5% (v/v) NP40 0.5 mM DTT complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer

4.7 g/l citric acid 9.2 g/l Na2HPO4 pH 5.0

IP-wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 300 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 500 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before the experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 20 mM EGTA 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2

PNK buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer

10% glycerol (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 12.5 mM EDTA 2% (w/v) SDS