PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

Summary

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

Abstract

RNA-transcripten worden onderworpen aan post-transcriptionele genregulatie door interactie met honderden RNA-bindende eiwitten (RBPs) en microRNA-bevattende ribonucleoproteïne complexen (miRNPs), die vaak worden uitgedrukt in een cel-type kelijk. Te weten hoe het samenspel van deze RNA-bindende factoren van invloed op de regulering van individuele transcripten, hoge resolutie kaarten van de in vivo eiwit-RNA interacties nodig ^{zijn: 1.}

Een combinatie van genetische, biochemische en computationele benaderingen worden meestal toegepast op RNA-RBP-of RNA-RNP interacties vast te stellen. Microarray profilering van RNA's geassocieerd met immunopurified RBPs (RIP-Chip) ² definieert doelen op een transcriptoom niveau, maar de toepassing ervan is beperkt tot de karakterisering van kinetisch stabiele interacties en slechts in zeldzame gevallen ^3,4 maakt het mogelijk om identificatie van de RBP erkenning element (RRE ) binnen de lange doelwit RNA. Meer directe RBP doelwit site informatie wordt verkregen door het combineren van in vivo UV-crosslinking ^5,6 met immunoprecipitatie ^7-9, gevolgd door de isolatie van vernette RNA segmenten en cDNA sequencing (CLIP) ^10. CLIP werd gebruikt om doelstellingen van een aantal RBPs ^11-17 te identificeren. Echter, is CLIP beperkt door de lage efficiëntie van de UV 254 nm RNA-eiwit verknoping, en de locatie van het verknopen is niet gemakkelijk herkenbaar binnen de gesequenced verknoopt fragmenten, waardoor het moeilijk is aan UV-verknoopte doelwit RNA-segmenten los van achtergrond niet-verknoopte RNA-fragmenten ook aanwezig in het monster.

We ontwikkelden een krachtige cell-based verknoping aanpak te bepalen met een hoge resolutie en transcriptoom-breed de bindingsplaatsen van cellulaire RBPs en miRNPs dat we term PAR-Clip (fotoactiveerbare-Ribonucleoside-Enhanced verknoping en Immunoprecipitatie) (zie Fig. 1A voor een overzicht van de methode). De methode is gebaseerd op de integratie van fotoreactieve ribonucleoside analogen, zoals 4-thiouridine (4-SU) en 6-thioguanosine (6-SG) in ontluikende RNA transcripten van levende cellen. Bestraling van de cellen door UV-licht van 365 nm induceert efficiënte verknoping van fotoreactief nucleoside-label cellulaire RNA's tot interactie RBPs. Immunoprecipitatie van de RBP van belang is, gevolgd door isolatie van de verknoopt en coimmunoprecipitated RNA. De geïsoleerde RNA wordt omgezet in een cDNA-bibliotheek en diepe gesequenced met behulp van Solexa technologie. Een karakteristieke eigenschap van cDNA-bibliotheken die door PAR-Clip is dat de precieze positie van de verknoping kan worden geïdentificeerd door mutaties die in de opeenvolgende cDNA. Bij gebruik van 4-SU, verknoopt sequenties thymidine aan cytidine overgang, terwijl met behulp van zes-SG resulteert in guanosine om mutaties adenosine. De aanwezigheid van de mutaties in verknoopte sequenties maakt het mogelijk om ze te scheiden van de achtergrond van de sequenties die afkomstig zijn van overvloedige cellulaire RNA's.

Toepassing van de methode om een aantal verschillende RNA-bindende eiwitten werd gemeld bij Hafner et al.. ¹⁸

Protocol

Het protocol beschrijft de PAR-Clip procedure voor HEK293 cellen die FLAG / HA-gelabeld IGF2BP1 na inductie met doxycycline. We zullen gebruik maken van een anti-FLAG antilichaam voor immunoprecipitatie.

PAR-Clip zal werken met elke cellijn die detecteerbare niveaus van de endogene, niet-gecodeerde RNA bindend eiwit (RBP) van belang als een efficiënte antilichaam voor immunoprecipitatie beschikbaar is.

Uitbreiding van cellen

1. Uit te breiden FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellen in groei medium. Wij raden u aan tussen de 100 tot 400 x 10 ⁶ cellen (ca. 10-40 15 cm celkweek platen) als uitgangspunt. Groeien ze ongeveer 80% confluentie.
2. 14 uur voor crosslinking toevoegen) 4-thiouridine tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM (1:1000 v / v van een 1 M 4-thiouridine voorraad-oplossing) rechtstreeks naar de cel kweekmedium en b), leiden tot uitdrukking van de FLAG / HA getagd IGF2BP1 door toevoeging van 1 ug / ml doxycycline (1:10.000 v / v van 10 mg / ml doxycycline voorraad-oplossing). LET OP: in plaats van 4-thiouridine kunt u ook gebruik maken van 100 pM van 6-thioguanosine.

UV-crosslinking

1. Een keer wassen cellen met 10 ml ijskoude PBS per plaat en volledig te verwijderen PBS.
2. Plaats borden op een dienblad met ijs en bestralen ontdekt met 0,15 J / cm ² van 365 nm UV-licht in een Stratalinker 2400 (Stratagene) of soortgelijk apparaat.
3. Schraap cellen af ​​met een rubberen politieman in 1 ml PBS per plaat, over te dragen aan 50 ml centrifugeren buizen en verzamelen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C en gooi het supernatant. 100 x 10 ⁶ HEK293 cellen (10 15 cm platen) zal opleveren ca.. 1 ml van de natte cel pellet.
4. (Optioneel) Tenzij u rechtstreeks wilt doorgaan met cellysis, shock bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Celpellets kunnen worden opgeslagen voor ten minste 12 maanden.

Cellysis en RNaseT1 verteren

1. Neem celpellet van verknoopt cellen in drie volumes van 1x NP40 lysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
2. Duidelijke cellysaat door centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
3. Schakel het lysaat verder door te filteren door een 0,2 um membraan spuitfilter (Pall Acrodisc of gelijkwaardig).
4. Voeg RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / pl) tot een uiteindelijke concentratie van 1 U / pl en incuberen in een waterbad gedurende 15 minuten bij 22 ° C. Cool reactie vervolgens gedurende 5 minuten op ijs voordat u verder gaat.

Immunoprecipitatie en herstel van verknoopt doelwit RNA-fragmenten

Met behulp van de magnetische separator

Volg deze richtlijnen in het monster voorbereiding op de magnetische korrels te voorkomen dat uitdroogt.

1. Plaats de buis met de kralen op de magnetische staan ​​een 2 minuten.
2. Voeg de buffer op de buis, terwijl de buis op de magnetische separator.
3. Dop van de tube, verwijder het uit de magnetische scheider, en resuspendeer de kralen. U kunt resuspendeer de kralen door flicking de buis met uw vinger of gebruik een vortexer vastgesteld op 5 6.
4. Centrifuge kort om alle kralen die kunnen blijven in het dopje te verzamelen.
5. Herhaal de stappen 1 tot en met 4 zoals vereist.

Voorbereiding van de magnetische beads

1. Breng 10 ul van Dynabeads Proteïne G magnetische deeltjes (Invitrogen) per ml cellysaat (voor een typisch experiment moet worden ca.. 40 50 ul van kralen) naar een 1,5 ml microfugebuis. Twee keer wassen kralen met 1 ml citraat-fosfaat buffer.
2. Resuspendeer twee keer het volume van de citraat-fosfaat buffer ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de kraal schorsing.
3. Voeg 0,25 ug van anti-FLAG M2 monoklonaal antilichaam (Sigma) per ml suspensie en incubeer op een roterend wiel gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.
4. Twee keer wassen kralen in 1 ml citraat-fosfaat buffer om ongebonden antilichamen te verwijderen.
5. Resuspendeer kralen in twee keer het volume van de citraat-fosfaat buffer ten opzichte van het oorspronkelijke volume van de kraal schorsing.

Immunoprecipitatie (IP), tweede RNase T1 spijsvertering, en defosforylering

1. Voeg 20 ul van vers bereide antilichaam-geconjugeerde magnetische korrels per ml van de gedeeltelijke RNase T1 behandeld cellysaat en incubeer in 15 ml centrifugeren buisjes op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 4 ° C.
2. Verzamel magnetische kralen aan een magnetische deeltjes collector voor 15 en 50 ml centrifugeren buizen (Invitrogen) en over te dragen aan 1,5 ml microfugebuisje buizen.
3. Was kralen 3 keer in 1 ml van IP wasbuffer.
4. Voeg RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / pl) tot een uiteindelijke concentratie van 100 U / ul toe en incubeer de kraal suspensie in een waterbad gedurende 15 minuten bij 22 ° C. Koel vervolgens op ijsgedurende 5 minuten.
5. Was kralen 3 keer in 1 ml van een hoge-zout wasbuffer.
6. Resuspendeer kralen in een volume van defosforylering buffer
7. Voeg kalf intestinale alkalische fosfatase (CIAP, NEB) tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 U / pl, en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
8. Twee keer wassen kralen in 1 ml fosfatase wasbuffer
9. Was kralen tweemaal in polynucleotide kinase (PNK) buffer zonder DTT (de DTT concentratie nodig zijn voor de enzymatische reactie is hoog genoeg om de magnetische korrels schade).
10. Resuspendeer kralen in een originele kraal volume van PNK buffer

Radiolabeling van RNA segmenten verknoopt aan immunogeprecipiteerd eiwitten

1. Om de kraal schorsing hierboven beschreven, toe te voegen ^Υ-32 P-ATP tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 uCi / ul en T4 PNK (NEB) tot 1 U / ul in een origineel kraal volume. Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
2. Voeg niet-radioactieve ATP tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM te verkrijgen en voor nog eens 5 minuten incuberen bij 37 ° C.
3. Was de magnetische korrels 5 keer met 800 ul van PNK buffer zonder DTT.
4. Resuspendeer de parels in 70 pl van SDS-PAGE laadbuffer.

SDS-PAGE en elektro van verknoopt RNA-eiwit-complexen van de gel plakken

1. Incubeer de radioactief gelabelde schorsing voor 5 min in een warmte-blok bij 95 ° C te denatureren en laat de immunogeprecipiteerd RBP met verknoopt RNA en vortex.
2. Verwijder de magnetische korrels op de afscheider en breng het supernatant naar een schone 1,5 ml microfugebuis.
3. Belasting 40 ul van de supernatant per putje van een Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) prefab polyacrylamidegel en laat de gel voor 55 min bij 200 V.
4. Demonteer de gel kamer en afbreken van de gel, waarbij het gemonteerd op een plaat. Ter bevordering van de uitlijning van de gel op de phosphorimager papieren afdruk, raden wij aan het implanteren van drie kleine radioactieve gel stukjes asymmetrisch op drie van de vier hoeken van de gel. Radioactieve gel stukken kunnen worden afgehaald bij gels die voorheen werden gebruikt om radioactief gelabelde synthetische oligonucleotiden te zuiveren. Wikkel de gel in plastic folie (bv Saran wrap) om besmetting te voorkomen.
5. Expose de gel om een ​​blanco phosphorimager scherm voor 1 uur en visualiseren op een phosphorimager.
6. Lijn de gel op de top van de phosphorimager afdruk met behulp van de geïmplanteerde gel stukken voor oriëntatie. Knip de bands die overeenkomen met de verwachte grootte van RBP (IGF2BP1, ca.. 75 kDa) en over te dragen aan een D-Tube kunstnier Midi Tube en voeg 800 ul 1x SDS lopen buffer.
7. Electroelute de verknoopte RNA-RBP-complex in 1x SDS draait buffer bij 100 V gedurende 2 uur uitgesneden uit de gel en electroeluted in een D-Tube kunstnier Midi (Novagen) in 800 pl SDS buffer loopt volgens de instructies van de fabrikant.

Proteinase K spijsvertering

1. Voeg een gelijk volume van 2x proteïnase K-buffer met betrekking tot de electroeluate, gevolgd door de toevoeging van proteïnase K (Roche) tot een uiteindelijke concentratie van 1,2 mg / ml. Incubeer gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
2. Herstel de RNA door zure fenol / chloroform / IAA extractie (25:24:1, pH 4,0), gevolgd door een chloroform extractie. Voeg 1 ui glycogeen (10 mg / ml voorraad) neerslag het RNA door het toevoegen van drie volumes ethanol. Los de pellet in 10,5 ul water.

cDNA-bibliotheek voorbereiding en diepe sequencing

Draag de herstelde RNA door middel van een standaard-cDNA-bibliotheek voorbereiding protocol oorspronkelijk beschreven voor het klonen van kleine RNA's de regelgeving ^19. De eerste stap, 3 'adapter ligatie werd uitgevoerd zoals beschreven op een 20 ul schaal met behulp van 10,5 ul van de herstelde RNA. Gebruik de Solexa sequencing adapter sets beschreven. Afhankelijk van de hoeveelheid RNA hersteld, kan 5'-adapter-3'-adapter producten zonder inserts worden gedetecteerd na amplificatie van het cDNA als extra PCR-bands. In dergelijke gevallen, accijnzen op de langere PCR-product van de verwachte grootte van een 3% NuSieve lage smeltpunt agarose gel, elueren het PCR-product uit de gel stukken met behulp van de GelElute kit (Qiagen) en sequentie met behulp van de Solexa technologie. Een Solexa sequencing run biedt meestal tussen de 6 en 10 miljoen volgorde leest dat genoeg zijn voor een transcriptoom brede dekking van de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten.

Bioinformatische analyse

Zorgvuldige bio analyse van de volgorde leest moet worden gedaan om betekenisvolle inzicht te krijgen in de RNA bindingsplaatsen voor de onderzochte RBP, zoals de erkenning van RNA element, de voorkeur binding regio's van de RBP heeft (exonic vs intronische, coderende sequentie versus niet-vertaalde volgorde). De volgorde leest moeten worden aangepast tegen het genoom en EST databases. We gebruiken meestal leest Mapping unieke aan het genoom met maximaal een mismatch, insertie of deletie tot clusters van sequentie te bouwen leest die vervolgens verder kan worden geanalyseerd. De frequentie van karakteristieke mutaties in de geclusterde opeenvolgende leest, T naar C overgangen bij gebruik van 4-SU en G naar A overgangen bij het gebruik van zes-SG, zijn indicatief voor succes verknoopt sequenties. In onze ervaring niet-verknoopte RNA's voorzien van 4-SU vertonen een achtergrond mutatie snelheid van ongeveer 20%. Dit tarief is vergroot tot ca.. 50-80% bij de verknoping.

Een gedetailleerde beschrijving van de bioinformatica analyse kan worden gevonden in het Aanvullend materiaal van de publicatie door Hafner et al.. ¹⁸

Optionele stappen

Bepaling van de incorporatie niveaus van 4-thiouridine in totale RNA

Isoleer totaal RNA uit de cel lijn stabiel uiting van de RBP van de belangstelling na een groei in het medium aangevuld met 100 uM 4SU 16 uur voorafgaand aan de oogst. Als een controle-, oogst-cellen gekweekt zonder 4SU toevoeging. Isoleer totaal RNA door de toevoeging van drie volumes TRIzol reagens (Sigma) om de gewassen celpellets volgens de fabrikant de instructies. was verder te zuiveren totaal RNA met behulp van Qiagen RNeasy volgens protocol van de fabrikant. Om te voorkomen dat oxidatie van 4SU tijdens de RNA-isolatie en analyse, voeg 0,1 mM dithiothreitol (DTT) om de buffers te wassen en de daaropvolgende enzymatische stappen. Digest en gedefosforyleerd totaal RNA om enkele nucleosiden voor HPLC-analyse zoals eerder beschreven ^20. Kortom, in een 30 ul volume, incubeer 40 ug van gezuiverd totaal RNA waren voor 16 uur bij 37 ° C met 0,4 U bacteriële alkalische fosfatase (Worthington Biochemical) en 0,09 U slangengif fosfodiësterase (Worthington Biochemical). Als referentie standaard, gebruik maken van een synthetische 4SU-gelabelde RNA, (we standaard gebruiken CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) en ook onderworpen aan enzymatische vertering te voltooien. Scheid de verkregen mengsels van ribonucleosides door HPLC op een Supelco Discovery C18 (gebonden fase silica 5 uM deeltje, 250 x 4,6 mm) reverse-phase kolom (Bellefonte PA, USA). HPLC buffers zijn 0,1 M Teaa in 3% acetonitril (A) en 90% acetonitril in water (B). Gebruik een isocratische gradiënt: 0% B gedurende 15 min, 0 tot 10% B gedurende 20 min, 10 tot 100% B gedurende 30 minuten. Breng een 5 min 100% B was aangebracht tussen loopt schoon te maken de HPLC-kolom.

Representatieve resultaten

Figuur 1 (rechter paneel) toont een representatief resultaat van een PAR-Clip uitgevoerd met cellijnen uiten van FLAG / HA-gelabeld IGF2BP1 met 4-SU en 6-SG. Merk op dat de verknoping efficiëntie van de 6-SG voor IGF2BP1 lager is dan de verknoping efficiëntie voor 4-SU. De lagere crosslinking rendement zal resulteren in een hogere achtergrond van de sequenties die afkomstig zijn uit fragmenten van overvloedige cellulaire RNA's en daarom moet u overwegen het opschalen van het experiment bij het gebruik van minder efficiënte fotoreactief nucleosiden.

Het linker paneel van Figuur 1 toont een vergelijking van het gebruik van verschillende fotoreactief uridine-analogen die mogelijk voor PAR-Clip gebruikt ten opzichte van traditionele UV 254 nm crosslinking.

De intensiteit van de radioactieve band van de juiste lengte geeft u een goed idee of de PAR-Clip experiment heeft gewerkt en je hebt voldoende geïsoleerde RNA uit te voeren door middel van een kleine RNA-sequencing protocol (stap-voor-stap beschrijving voor de cDNA-bibliotheek voorbereiding van de kleine RNA-sequencing kunnen worden gevonden in ^19). De frequentie van karakteristieke mutaties in de volgorde leest, T naar C overgangen bij gebruik van 4-SU en G naar A overgangen bij het gebruik van zes-SG, zijn indicatief voor succes verknoopt sequenties. In onze ervaring niet-verknoopte RNA's voorzien van 4-SU vertonen een achtergrond mutatie snelheid van ongeveer 20%. Dit tarief is vergroot tot ca.. 50-80% bij de verknoping.

Materials

Buffers and reagents

Growth medium HEK293 cells

DMEM 10% FBS 2 mM L-Glutamine 100 U/ml penicillin 100 U/ml streptomycin 100 μg/ml hygromycin 15 μg/ml blasticidin

4-thiouridine stock solution (1 M)

260.27 mg 4-thiouridine 1 ml DMSO

Doxycyclin stock (10 mg/ml)

10 mg doxycyclin 1 ml DMSO

1x NP40 lysis buffer

Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.

50 mM HEPES, pH 7.5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0.5% (v/v) NP40 0.5 mM DTT complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)

Citrate-Phosphate buffer

4.7 g/l citric acid 9.2 g/l Na2HPO4 pH 5.0

IP-wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 300 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before experiment)

High-salt wash buffer

50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 500 mM KCl 0.05% (v/v) NP40 0.5 mM DTT (add directly before the experiment) complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) (add directly before the experiment)

Dephosphorylation buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT

Phosphatase wash buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 20 mM EGTA 0.5% (v/v) NP40

Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2

PNK buffer

50 mM Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT

SDS PAGE loading buffer

10% glycerol (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0.1% bromophenol blue

2x Proteinase K buffer

100 mM Tris-HCl, pH 7.5 150 mM NaCl 12.5 mM EDTA 2% (w/v) SDS