RNA転写物は、トランス作用RNA結合タンパク質(RBPs)の多数によって媒介される大規模な転写後調節の対象となります。ここでは正確にとトランスクリプトーム全体の規模でRBPsのRNA結合部位を同定するために一般化の方法を提示する。
RNA転写産物は、RNA結合タンパク質(RBPs)とマイクロRNAを含む、多くの場合依存的細胞型において発現されるリボ核タンパク質複合体(miRNPs)の何百と相互作用することによって転写後の遺伝子発現制御に供される。これらのRNA結合因子の相互作用は、個々の転写産物の規制をどのように影響するかを理解するために、in vivoでのタンパク質- RNA相互作用での高解像度の地図は1が必要です。
遺伝的、生化学的および計算的アプローチの組み合わせは一般的にRNA – RBPまたはRNA – RNP相互作用を識別するために適用されます。免疫精製RBPsに関連付けられているRNAのマイクロアレイプロファイリング(RIP -チップ)2は、トランスクリプトームレベルでの目標を定義しますが、そのアプリケーションは、速度論的に安定な相互作用の特性に制限されており、のみまれに3,4 RBP認識の要素(RREを識別することができます)長い標的RNA中。より直接的なRBPのターゲットサイトの情報は、架橋RNAセグメントの分離とcDNAのシークエンシング(CLIP)10に続いて免疫沈降7月9日 の in vivoのUV架橋5,6 で結合することによって得られる。 CLIPはRBPs 11月17日の数のターゲットを識別するために使用されました。しかし、CLIPはUV 254 nmのRNA -タンパク質架橋の効率が低いことによって制限されており、架橋の位置は、それが困難な背景の非架橋からUV -架橋標的RNAセグメントを分離すること、塩基配列架橋フラグメント内に容易に識別可能ではないRNAはまた、サンプル中に存在するフラグメント。
我々は、高解像度と携帯RBPsとmiRNPsのトランスクリプトーム全体の結合部位で決定するために強力な細胞系架橋アプローチを開発している我々の用語PAR -クリップ(光活性化-リボヌクレオシド-強化された架橋と免疫)(概要は図1Aを参照してくださいメソッドの)。方法は、生きた細胞によって新生RNA転写物に、例えば4 – チオウリジン(4 – SU)と6 -チオグアノシン(6 – SG)のような光反応性リボヌクレオシド類縁体の取り込みに依存しています。 365nmの紫外光による細胞の照射は、相互作用RBPsに光反応性ヌクレオシド標識細胞のRNAの効率的な架橋を誘導する。興味のRBPの免疫沈降は、架橋と共免疫沈降RNAの分離が続いている。単離されたRNAは、cDNAライブラリーに変換し、深いSolexaの技術を用いて配列決定される。 PAR -クリップが作成したcDNAライブラリーの一つの特徴は、架橋の正確な位置を配列決定したcDNA内に存在する変異によって識別できることです。突然変異をアデノシンにグアノシンに6 – SGの結果を使用して、一方シチジンへの移行4 – SUを使用して、架橋のシーケンスはチミジン、。架橋配列における変異の存在は、豊富な細胞のRNAから由来する配列の背景からそれらを分離することが可能になります。
多様なRNA結合タンパク質の数に方式のアプリケーションは、ハーフナーらに報告されている。18
The authors have nothing to disclose.
我々は有用な議論のためTuschl研究室のメンバーに感謝。 MHは、ドイツ学術交流会(DAAD)によってサポートされています。この作品は、スイス国立基金助成MZへ#3100A0 – 114001によってサポートされていました; TTは、HHMIの研究者でもある、と彼の研究室での作業は、NIHの助成金GM073047とMH08442とスター財団によってサポートされていました。
Buffers and reagents
Growth medium HEK293 cells
4-thiouridine stock solution (1 M)
Doxycyclin stock (10 mg/ml)
1x NP40 lysis buffer
Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.
Citrate-Phosphate buffer
IP-wash buffer
High-salt wash buffer
Dephosphorylation buffer
Phosphatase wash buffer
Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT
PNK buffer
SDS PAGE loading buffer
2x Proteinase K buffer