Protokollet nedan beskriver PAR-Clip förfarande för HEK293 celler som uttrycker sjunker / HA-märkta IGF2BP1 vid induktion med doxycyklin. Vi kommer att använda en Anti-Flag antikropp för immunoprecipitation. PAR-Clip fungerar med alla cellinje som uttrycker detekterbara halter av den endogena, omärkta RNA bindande protein (RBP) av intresse om en effektiv antikropp för immunoprecipitation finns tillgänglig. Expanderande Celler Expandera FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellerna i odlingsmedium. Vi rekommenderar att du använder mellan 100-400 x 10 6 celler (ca 10 till 40 15 cm cellkultur plattor) som utgångspunkt. Odla dem till cirka 80% confluency. 14 timmar före crosslinking lägga en) 4-thiouridine till en slutlig koncentration av 100 mikroM (1:1000 v / v av en 1 M 4-thiouridine stamlösning) direkt till cellkulturmedium och b) inducerar uttryck av flaggan / HA taggade IGF2BP1 genom tillsats av 1 mikrogram / ml av doxycyklin (1:10,000 v / v på 10 mg / ml doxycyklin stamlösning). OBS: i stället för 4-thiouridine du kan också använda 100 mikroM av 6-thioguanosine. UV-crosslinking Tvätta cellerna gång med 10 ml iskall PBS per platta och ta PBS helt. Placera plattorna på en bricka med is och bestråla avtäckt med 0,15 J / cm 2 365 nm, UV-ljus i en Stratalinker 2400 (Stratagene) eller liknande anordning. Skrapa celler bort med en gummi polis i 1 ml PBS per platta, transfer till 50 rör ml centrifugering och samla in genom centrifugering vid 500 xgi 5 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanten. 100 x 10 6 HEK293-celler (10 15 cm plattor) kommer att ge ca. 1 ml av våt cellpelleten. (Tillval) Om du inte vill fortsätta direkt med cellslys, chock frysa cellpelleten i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Cell pellets kan lagras i minst 12 månader. Cellslys och RNaseT1 smälta Ta upp cellpelleten av tvärbunden celler i tre volymer av 1x NP40 lyseringsbuffert och inkubera på is i 10 min. Rensa cell lysat genom centrifugering vid 13.000 xgi 15 minuter vid 4 ° C. Rensa lysat ytterligare genom att filtrera den genom en 0,2 ìm membran spruta filter (Pall Acrodisc eller motsvarande). Lägg RNas T1 (Fermentas, 10000 U / l) till en slutlig koncentration av 1 U / l och inkubera i ett vattenbad under 15 minuter vid 22 ° C. Cool reaktion därefter i 5 minuter på is innan du fortsätter. Immunoprecipitation och återvinning av tvärbunden target RNA fragment Använda den magnetiska separatorn Följ dessa riktlinjer i hela provberedning för att förhindra att magnetiska kulor från att torka ut. Placera röret med pärlor på den magnetiska stå i 1 2 minuter. Lägg bufferten till röret när röret är på den magnetiska separatorn. Cap röret, ta bort den från den magnetiska separatorn, och suspendera pärlor. Du kan resuspendera kulorna genom att ställa röret med fingret eller använda ett vortexer inställd på 5 6. Centrifugera kort att samla alla pärlor som kan finnas kvar i röret locket. Upprepa steg 1 till 4 efter behov. Beredning av magnetiska kulor Överför 10 ìl Dynabeads Protein G magnetiska partiklar (Invitrogen) per ml cell lysat (för ett typiskt experiment bör det vara ca. 40 50 ìl av pärlor) till en 1,5 ml mikrofugrör. Tvätta pärlor två gånger med 1 ml av citrat-fosfat buffert. Resuspendera i dubbelt så stor volym av citrat-fosfat buffert i förhållande till den ursprungliga volymen pärla suspension. Tillsätt 0,25 mikrog av Anti-Flag M2 monoklonal antikropp (Sigma) per ml suspension och Inkubera på en roterande hjul för 40 minuter i rumstemperatur. Tvätta pärlor två gånger i 1 ml av citrat-fosfat buffert för att ta bort obundna antikroppar. Återsuspendera pärlor i två gånger volymen av citrat-fosfat buffert i förhållande till den ursprungliga volymen pärla suspension. Immunoprecipitation (IP), andra RNas T1 matsmältning och defosforylationen Tillsätt 20 l nyberedd antikropp-konjugerade magnetiska kulor per ml av partiella RNas T1 behandlas cell lysat och inkubera i 15 tuber ml centrifugering på ett roterande hjul för 1 h vid 4 ° C. Samla magnetiska kulor på ett magnetiskt partikel samlare för 15 och 50 ml centrifugering rör (Invitrogen) och överför till 1,5 rör ml mikrofugrör. Tvätta pärlor 3 gånger i 1 ml IP tvättbuffert. Lägg RNaseT1 (Fermentas, 10000 U / l) till en slutlig koncentration av 100 E / l och inkubera pärla suspension i ett vattenbad under 15 minuter vid 22 ° C. Cool därefter på isi 5 min. Tvätta pärlor 3 gånger i 1 ml av hög salt tvättbuffert. Återsuspendera pärlor i en mängd defosforylationen buffert Lägg kalv intestinal alkaliska fosfataser (CIAP, NEB) till en slutlig koncentration av 0,5 U / l, och inkubera suspensionen i 10 min vid 37 ° C. Tvätta pärlor två gånger i 1 ml fosfatas tvättbuffert Tvätta pärlor två gånger i polynucleotide kinas (PNK) buffert utan DTT (DTT-koncentration som är nödvändig för den enzymatiska reaktionen är tillräckligt hög för att skada magnetiska kulor). Återsuspendera pärlor i ett original pärla volym PNK buffert Radioaktiv inmärkning av RNA segment tvärbundet till immunoprecipitated proteiner Till pärla fjädring som beskrivs ovan, lägg Υ-32 P-ATP till en slutlig koncentration av 0,5 μCi / l och T4 PNK (NEB) till 1 U / l i ett original pärla volym. Inkubera suspension 30 minuter vid 37 ° C. Lägg till icke-radioaktiva ATP för att få en slutlig koncentration av 100 mikroM och inkubera i ytterligare 5 minuter vid 37 ° C. Tvätta magnetiska kulor 5 gånger med 800 ìl PNK buffert utan DTT. Resuspendera pärlor i 70 ìl av SDS-PAGE buffert. SDS-PAGE och electroelution av tvärbunden RNA-protein komplex från gelen skivor Inkubera radioaktivt märkt fjädring i 5 minuter i ett värmeblock vid 95 ° C att denaturera och släpp immunoprecipitated RBP med tvärbunden RNA och skaka. Ta bort magnetiska kulor på avskiljaren och överför supernatanten till ett rent 1,5 ml mikrofugrör. Belastning 40 l av supernatanten per brunn av en Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) prefabricerade polyakrylamidgel och kör gel för 55 min vid 200 V. Demontera gelen kammaren och demontera gel, lämnar den monterad på en tallrik. För att underlätta anpassningen av gel till phosphorimager pappersutskrift rekommenderar vi implanterar tre små radioaktiva gel bitar asymmetriskt på tre av de fyra hörnen av gelen. Radioaktiva gel bitar kan samlas in från geler som tidigare användes för att rena radioaktivt syntetiska oligonukleotider. Linda gelen i plastfilm (t ex Saran wrap) för att undvika kontaminering. Exponera gel till ett tomt phosphorimager skärm för 1 timme och visualisera på en phosphorimager. Rikta in gelen ovanpå phosphorimager utskriften med implanterade gelen stycken för orientering. Skär ut band som motsvarar den förväntade storleken på RBP (IGF2BP1, ca. 75 kDa) och överför till en D-Tube dialysatorn Midi Tube och tillsätt 800 l 1x SDS löpande buffert. Electroelute den tvärbundet RNA-RBP komplex i 1x SDS löpande buffert på 100 V för 2 h. exciderad från gel och electroeluted i en D-Tube dialysatorn Midi (Novagen) i 800 l SDS löpande buffert enligt tillverkarens anvisningar. Proteinas K matsmältningen Lägg till en lika stor volym 2x proteinas K Buffert med avseende på electroeluate, följt av tillsats av proteinas K (Roche) till en slutlig koncentration av 1,2 mg / ml. Inkubera i 30 minuter vid 55 ° C. Återvinn RNA med sura fenol / kloroform / IAA utvinning (25:24:1, pH 4,0) följt av en kloroform extraktion. Tillsätt 1 l av glykogen (10 mg / ml lager) fällning RNA genom att lägga tre volymer av etanol. Lös upp pelleten i 10,5 l vatten. cDNA bibliotek beredningen och djupa sekvensering Bär återhämtade RNA genom en standard cDNA-bibliotek förberedelse protokoll ursprungligen beskrevs för kloning av små reglerande RNA 19. Det första steget, 3 "adapter ligation, utfördes enligt beskrivning på en 20 l skala med hjälp av 10,5 l av det återvunna RNA. Använd Solexa sekvensering adaptern som beskrivs. Beroende på mängden av RNA som återvunnits, kan 5'-adapter-3'-adapter produkter utan insatser detekteras efter amplifiering av cDNA som extra PCR-band. I sådana fall punktskatter längre PCR-produkt av förväntad storlek från 3% NuSieve låg smältpunkt agarosgel, eluera PCR-produkten från gelen bitarna med GelElute kit (Qiagen) och sekvens med Solexa tekniken. Ett Solexa sekvensering köra ger vanligtvis mellan 6 och 10 miljoner sekvens läsningar som är tillräckligt för en transkriptom god täckning av bindningar på RNA bindande proteiner. Bioinformatisk analys Noggrann bioinformatiska analyser av sekvensen läser behöver göras för att få meningsfulla insikter i RNA bindningsställen för de undersökta RBP, såsom RNA erkännande elementet, den föredragna bindande regioner RBP har (exonic vs intronic, kodning sekvens vs oöversatta sekvens). Sekvensen läser måste anpassas mot det humana genomet och EST databaser. Vi använder vanligtvis läser mapping unikt att arvsmassan med upp till en obalans, införande eller borttagande att bygga kluster av serie läsningar som sedan kan ytterligare analyseras. Frekvensen av karakteristiska mutationer i klustrade sekvenserade läser, T till C övergångar när man använder 4-SU och G till A övergångar vid användning av 6-SG, vittnar om framgång tvärbundet sekvenser. Enligt vår erfarenhet uncrosslinked RNA märkta med 4-SU visar en hastighet bakgrund mutation av cirka 20%. Denna siffra har ökar till ca. 50-80% på crosslinking. En detaljerad beskrivning av de bioinformatiska analyser finns i den kompletterande material av offentliggörandet av Hafner et al. 18 Valfria steg Fastställande av bolagsordning halter av 4-thiouridine i total RNA Isolera totala RNA från cellinje stabilt uttrycker RBP intresse efter att ha ökat i medelstora kompletteras med 100 mikroM 4SU 16 h före skörd. Som en kontroll, skörd celler som odlas utan 4SU tillägg. Isolera totala RNA genom tillsats av 3 volymer av Trizol reagens (Sigma) till tvättas cellen pellets enligt tillverkarens anvisningar. ytterligare rena totala RNA med hjälp av Qiagen RNeasy enligt tillverkarens protokollet. För att förhindra oxidering av 4SU under RNA-isolering och analys, lägga 0,1 mM ditiotreitol (DTT) till tvätta buffertar och efterföljande enzymatiska steg. Smälta och defosforyleras totala RNA till enstaka nukleosider för HPLC-analys som beskrivs som tidigare 20. Kortfattat, i en 30 l volym, inkubera 40 mikrogram av renat totala RNA var för 16 h vid 37 ° C med 0,4 U bakteriell alkaliska fosfataser (Worthington Biokemisk) och 0,09 U ormgift fosfodiesteras (Worthington Biochemical). Som referens standard, använder en syntetisk 4SU-märkt RNA, (vi standardmässigt använder CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) och även av den är klar enzymatisk spjälkning. Separera de erhållna blandningarna av ribonucleosides med HPLC på en Supelco Discovery C18 (bundna fas kiseldioxid 5 mikroM partikel, 250 x 4,6 mm) omvänd fas kolumn (Bellefonte PA, USA). HPLC-buffertar är 0,1 M TEAA i 3% acetonitril (A) och 90% acetonitril i vatten (B). Använd en isokratisk lutning: 0% B i 15 min, 0 till 10% B för 20 min, 10 till 100% B för 30 min. Applicera en 5 min 100% B tvätta tillämpas mellan körningar för att rengöra i HPLC-kolonnen. Representativa resultat Figur 1 (högra panelen) visar ett representativt resultat av en PAR-Clip utförs med cellinjer som uttrycker sjunker / HA-märkta IGF2BP1 med 4-SU och 6-SG. Observera att crosslinking effektiviteten i 6-SG för IGF2BP1 är lägre än crosslinking effektivitet för 4-SU. Den lägre crosslinking effektivitet kommer att resultera i en högre bakgrund av sekvenser från fragment av riklig cellulära RNA och därför bör du överväga att skala upp försöket när man använder mindre effektiv fotoreaktiva nukleosider. Den vänstra panelen i Figur 1 visar en jämförelse av att använda olika fotoreaktiva uridin analoger som kan potentiellt användas för PAR-Clip jämfört med traditionell UV 254 nm crosslinking. Intensiteten av det radioaktiva band av rätt längd ger dig en god uppfattning om PAR-Clip experiment har fungerat och du har isolerat tillräckligt med RNA att genomföra en liten RNA-sekvensering protokoll (steg-för-steg beskrivning för cDNA-bibliotek beredning av små RNA-sekvensering finns i 19). Frekvensen av karakteristiska mutationer i sekvenserade läser, T till C övergångar när man använder 4-SU och G till A övergångar vid användning av 6-SG, vittnar om framgång tvärbundet sekvenser. Enligt vår erfarenhet uncrosslinked RNA märkta med 4-SU visar en hastighet bakgrund mutation av cirka 20%. Denna siffra har ökar till ca. 50-80% på crosslinking.