Summary
Geregisseerd differentiatie van hESC 's in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van de
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) hebben een onbeperkte capaciteit voor zelf-vernieuwing, en de mogelijkheid om te differentiëren in cellen, afkomstig van alle drie de embryonale kiembladen (1). Geregisseerd differentiatie van hESC 's in specifieke celtypen heeft gegenereerd veel belangstelling op het gebied van regeneratieve geneeskunde (bv., (2-5)), en methoden voor het bepalen van de
Protocol
De schriftelijke protocol hieronder is gebaseerd op gepubliceerde parameters gerapporteerd door de auteurs, met enkele wijzigingen. Het protocol wordt uitgevoerd met toestemming van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik (IACUC) en Stem Cell Research Oversight (SCRO) comites.
I. Cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's)
- Groeien hESC 's in standaard 6-well (3,5 cm diameter putten) platen.
- Tenminste 12 uur voorafgaand aan de passage cellen, zaad muis embryonale fibroblasten (MEF, verkregen uit CF1 dag e12.5 timed-gekoppeld muizen, bestraald op 1000 Ci) feeder-cellen op platen bekleed met 1% gelatine (6,7). MEF moet worden uitgeplaat op 50-60% confluentie, of 4 x 10 5 cellen per 3,5 cm diameter goed (figuur 1).
- Passage-cellen wanneer kolonies hebben ~ 70% confluentie (figuur 2) bereikt.
- Om de passage van de cellen, aspireer KSR groeimedium (6) van de putten en te vervangen door 0,5 ml medium dat Collagenase IV in KSR bij een concentratie van 1 mg / ml.
- Incubeer de platen met Collagenase IV bij 37 ° C / 5% CO 2 gedurende 5 minuten of tot de randen van kolonies beginnen op te heffen van de plaat.
- Verwijderen Collagenase IV van de plaat, voeg 0,5 ml van KSR aan elk putje, en handmatig schraap cellen volledig te verwijderen van de plaat.
- Verzamel de celsuspensie uit elk putje, plaats in een 15 ml conische buis, en laat cellen door de zwaartekracht rusten gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de tube, waardoor de cellen en medium in een totaal volume van ~ 300μl.
- Met behulp van een 200 ul micro-pipet ingesteld op vol volume, voorzichtig pipet de celsuspensie 5-6 keer te breken de koloniën.
- Breng de celsuspensie tot een totaal volume van 9 ml per originele bron van cellen met behulp van KSR medium (dat wil zeggen, als een goed wordt geoogst, de buis moet 9 ml bevatten). Aanvulling op het medium met recombinant humaan basic fibroblast groeifactor (bFGF) tot een concentratie van 12,5 ng / ml.
- Na het wassen van de nieuwe putten met MEF-cellen (zie stap 2) met fosfaat Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (DPBS) om alle serum te verwijderen, 3 ml van de celsuspensie toe te voegen aan elk putje en de platen incubeer bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Verandering KSR medium met bFGF 24 uur na de passage, en iedere 24-48 uur totdat cellen zijn klaar om opnieuw te worden gepasseerd.
II. De voorbereiding van hESC pellet voor transplantatie
- Na 24 uur voor het enten, voeg ROCK-remmer aan de KSR medium tot een uiteindelijke concentratie van 10μM levensvatbaarheid van de cellen (8) te verhogen. Een bron van cellen op ~ 70% confluentie (5 x 10 5 cellen) zal leiden tot twee korrels, met twee pellets ingebracht per nier capsule.
- Ter voorbereiding celpellets voor het enten (9), incubeer de ROCK-remmer behandelde culturen met Collagenase IV gedurende 5 minuten bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Zuig het Collagenase IV uit de put en te vervangen door 1 ml DPBS met 10% penicilline / streptomycine (pen / strep).
- Handmatig de koloniën schrapen van de plaat, spoel het goed met een extra 1 ml DPBS met pen / STREP, en breng elke 1 ml aliquot van celsuspensie om een 1,5 ml microfugebuis.
- Kort Spin microfuge buizen op 8000 x g, zuig het supernatant en resuspendeer de pellets in 500μl DPBS met pen / strep.
- Om u te helpen bij elkaar te binden de cellen voor transplantatie, voeg 100μl 1 mg / ml Phaseolus vulgaris lectine (PHA) in DPBS aan elke buis.
- Incubeer de cel / PHA schorsing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en draai gedurende 2 minuten bij 8000 x g. Draai de buizen 180 ° binnen hun rotor putten en spin nogmaals gedurende 2 minuten bij 8000 x g.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans het verlaten van de pellet intact.
- Verjagen de cel pellets uit de buizen door zachtjes te pipetteren 200μl KSR naast de rand van de pellet totdat het langzaam verheft.
- Eenmaal verdreven, onmiddellijk overdracht van de pellets aan 0.4μm MILLICELL inserts geplaatst in 3,5 cm diameter putjes die 3 ml KSR, en incubeer gedurende 2 uur om 's nachts bij 37 ° C / 5% CO 2.
III. Nier-capsule enten
- Voer alle dierlijke procedures in overeenstemming met de institutionele richtlijnen met geschikte aseptische techniek.
- Verdoven SCID beige muizen (CB17.Cg-Prkdc SCID Lyst bg / CRL), in de leeftijd 8-12 weken, met behulp van een combinatie van inhalatiecorticosteroïden 3% isoflurane/0.5% O2 en intraperitoneale tribroomethanol (Avertin, 25 mg / kg vers bereid). Twee celpellets per muis zal worden geënt met beschreven technieken (10).
- Na het plaatsen van de muis op een verwarmingselement om onderkoeling te voorkomen, de incisie gebied scheren, daarna desinfecteren met chloorhexidine. Maak een 2.5 cm incisie door de huid net uit het midden, maar parallel aan de wervelkolom.
- Het houden van de incisie gebied vochtig met steriel Saline, maak een kleinere incisie door de spier, net onder de ribben en ~ 1 cm van de wervelkolom. De incisie moet net groot genoeg zijn om de nieren te trekken door, maar klein genoeg dat de nier niet zal terug glijden in de buikholte, zonder kracht.
- Trek de nier door de spier incisie met een glazen pipet Pasteur die is getrokken in de vorm van een stompe, licht gebogen haak.
- Nat de nier met steriele DPBS om de capsule niet uitdrogen. Dit kan nodig zijn om te herhalen gedurende de hele procedure, omdat de capsule is zeer fragiel.
- Met behulp van Dumont # 5 tang, trekt u de capsule op van de nieren en maak een 2 mm incisie met behulp van Vannas voorjaar schaar.
- Met een andere glazen pipet die is getrokken in een zeer fijne, afgestompte sonde, maak een klein zakje tussen de capsule en de nieren.
- Met behulp van een grote opening pipetpunt geplaatst op een wegwerp overdracht Pipetteer een enkele cel pellet van de MILLICELL te voegen. Zorg ervoor dat u zo weinig extra media mee te nemen als mogelijk, omdat teveel media kunnen interfereren met de pellet transfer.
- Terwijl de rand van de incisie aan de zak te creëren, plaats voorzichtig het pellet naast de opening en duw hem in de zak in de richting van een pool van de nier met de pipet getrokken.
- Herhaal dit proces met een tweede pellet. Plaats dit onder de capsule van de dezelfde nier, maar de richting van de tegenovergestelde pool.
- Plaats voorzichtig de capsule terug naar de pellets. De pellets moeten blijven binnen de pocket, en er geen hechtingen nodig zijn om de capsule te sluiten.
- Voorzichtig terug te duwen de nier in de buikholte en sluit de spier muur met 4-0 zijde hechtingen (of kleiner) met daaraan reverse-cutting naald. De incisie moet klein genoeg dat slechts een enkele hechting nodig is.
- Sluit de huid met een reeks van 4-5 onderbroken steken, met dezelfde hechtmateriaal.
- Voor het plaatsen van de muis terug in zijn kooi, toedienen 0,05 mg / kg buprenorfine (11,12) en 5 mg / kg ketoprofen (12,13) als op korte termijn en lange termijn analgetica, respectievelijk. Gereguleerde stoffen mag alleen worden gebruikt in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Zet het dier zijn kooi en laat het herstellen van narcose op een verwarmingselement. Dit duurt ongeveer 20-30 minuten.
- Zodra de muis volledig ambulant is, kan het worden teruggestuurd naar de stallen faciliteit.
IV. Teratoma oogst, fixatie en snijden
- Op 8-12 weken na de operatie, moet er een nauwelijks voelbaar teratoom de buurt van de nier. Grote, met vloeistof gevulde cysten zal vaak te ontwikkelen en, te beginnen bij 6-8 weken. Deze kan het nodig een eerdere oogst als ze leed veroorzaken voor het dier. Sinds teratomen groeien langzamer dan cysten, maar wil je zo lang mogelijk wachten om een teratoom van voldoende grootte voor analyse (dat wil zeggen, ten minste 8 weken) te verkrijgen.
- Verwijder de nieren, teratoom, en alle omringende cysten als een blok van weefsel uit de buikholte met behulp van dezelfde chirurgische benadering waarbij de nier oorspronkelijk was benaderd (zie hoofdstuk III, de stappen 1-4 hierboven).
- Plaats het hele blok van weggesneden weefsel in een buisje met 10% formaline gebufferd.
- Laat de teratoma een nacht vast te stellen op 4 ° C.
- De volgende dag, verwijder de teratoom van de buis. Ontleden weg te werken en zo veel cysten nieren mogelijk zonder beschadiging van de teratoma zelf (figuur 3). Grotere teratomen kan worden gesneden in de helft tot dissectie en verankering te vergemakkelijken.
- Verwerk de teratoma behulp van een standaard paraffine-fixatie techniek. Geautomatiseerde units zijn beschikbaar (bijvoorbeeld Shandon Hypercenter):
I. 80% Flex alcohol 2 uur II. 80% Flex alcohol 1 uur III. 85% Flex alcohol 1,5 uur IV. 95% Flex alcohol 1 uur V. 100% Flex alcohol 1 uur VI. 100% Flex alcohol 1 uur VII. 100% Flex alcohol 1 uur VIII. Clear-Rite 3 1 uur IX. Clear-Rite 3 1 uur X. Clear-Rite 3 1 uur XI. Paraffine (TissuePrep) 2 uur XII. Paraffine (TissuePrep) 2 uur
V. Immunohistochemie en analyse
- Eenmaal ingebed in paraffine, sectie teratoom in 5 urn seriële plakjes met behulp van een roterende microtoom, en zweven secties op dia's.
- Voor de kleuring, bak de dia's voor ten minste een uur.
- Vlekken op de dia's met hematoxyline en eosine met behulp van standaard methoden om weefsel structuren vertegenwoordiger van elk van de drie embryonale kiemlagen (figuur 4) te identificeren:
I. Xyleen wassen 3-5 minuten II. Xyleen 3-5 minuten III. 100% alcohol 3-5 minuten IV. 100% alcohol 3-5 minuten V. 95% alcohol 3-5 minuten VI. 80% alcohol 3-5 minuten VII. Water wassen (diverse wijzigingen) 2 minuten VIII. Gill's Hematoxylin # 3 2-5 minuten IX. Water wassen (diverse wijzigingen) tot het water helder X. Scott's water (naar blauw kernen) 3 minuten of meer XI. Water wassen (diverse wijzigingen) 1-2 minuten XII. Eosine Y 1 minuut XIII. Water wassen (diverse wijzigingen) 30 seconden XIV. 80% alcohol 1 minuut XV. 95% alcohol 2 minuten XVI. 95% alcohol 2 minuten XVII. 100% alcohol 3 minuten XVIII. 100% alcohol (schoon) 3 minuten XIX. Xyleen 2 minuten of meer XX. Xyleen 2 minuten of meer - Monteer een dekglaasje op elke dia met Permount.
VI. Representatieve resultaten
Figuur 1. Plating van bestraalde CF1 muis embryonale fibroblasten als een feeder-laag voor het kweken van ongedifferentieerde hESC 's. MEFs zijn verguld op ~ 50% confluentie, zoals hier getoond, of 4 x 10 5 cellen per 3,5 cm diameter goed in een 6-well cultuur schotel. Bar, 100 urn.
Figuur 2. Voorbeeld van subconfluent cultuur van ongedifferentieerde hESC 's op een MEF feeder-laag. HESC' s worden geteeld op MEF feeder lagen tot ~ 70% confluent, zoals hier, dan passage zoals beschreven. Bar, 100 urn.
Figuur 3. Voorbeeld van geëxplanteerde teratomen. Na explantatie, de teratoma, nier, en een accessoire weefsel worden vastgesteld als een blok in formaline, dan is de nier en accessoires weefsel worden zorgvuldig weggesneden voordat inbedding in paraffine.
Figuur 4. Teratomen afgeleid van ongedifferentieerde hESC 's bevatten weefsels representatief is voor alle drie de kiembladen in vivo. A teratoma, zoals een afgebeeld in figuur 3, werd in secties en gekleurd met hematoxyline en eosine om embryonale weefsels te identificeren. hESC 's aanleiding geven tot weefsels die van alle drie de embryonale kiembladen (ectoderm (A, B), mesoderm (C), endoderm (D). (A) Nascent neurale buis structuur. (B) Primitive plaveiselepitheel. (C) Kraakbeen, omgeven door kapsel van gecondenseerde mesenchym. (D) klieren intestinale structuur. Bar, 100 urn. Afbeeldingen herdrukt met toestemming van de auteur.
Figuur 5. Teratoom analyse kan worden gebruikt om het lot van de gelabelde, ongedifferentieerde hESC 's kaart. Zoals al eerder gepubliceerd (9), een mengsel van specifiek gelabeld hESC' s met gecodeerde hESC 's kunnen gebruikt worden om het lot van de gelabelde cellen in een teratoom formatie assay kaart. Zoals hier afgebeeld, waren ongedifferentieerde hESC 's uiting van de oppervlakte marker, CD133, en gelabeld met verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP), gemengd met niet-gecodeerde, ongedifferentieerde hESC' s. Deze werden gebruikt om teratomen formulier door renale capsule enten. Immunohistochemische analyse van hematoxyline en eosine gekleurd teratoom secties met anti-eGFP antilichaam toont de neuro-ectodermale lot van de CD133 + hESC 's. Teratomen werden verwerkt zoals in figuur 4 en tegengekleurd met anti-eGFP antilichaam (bruin) te lokaliseren derivaten van CD133 + GFP + cellen in weefsels. CD133 +-afgeleide cellen (pijlen) werden waargenomen in de weefsels die voortkomen uit embryonale ectoderm, in het bijzonder neurale epitheel (links) en ontluikende neurale buis-achtige structuren (rechts). Bar, 100 urn. Afbeeldingen herdrukt met toestemming van de auteur.
Gelatine
- 0,1% Porcine gelatine
- 99,9% DPBS
- Voeg gelatine aan DPBS, incuberen bij 37 ° C gedurende een uur of totdat alle gelatine in oplossing gaat, en het filter steriliseren (0.22μm) voor gebruik.
MEF medium
- 10% foetaal runderserum (Qualified)
- 90% Dulbecco's Modified Essential Medium (D-MEM)
- 1x L-Glutamine
- 1x Pen / Strep
- Filter steriliseren voor gebruik.
KSR (Knockout Serum Replacement) medium
- 20% KnockOut Serum Vervanging
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-Glutamine
- 1x niet-essentiële aminozuren
- 0,1 mM β-mercapto-ethanol /
- 12,5 ng / ml bFGF
- Filter steriliseren.
- Bewaren bij 4 ° C, maar warm tot 37 ° C voor het toevoegen aan cellen.
- Voeg bFGF onmiddellijk voor gebruik.
Collagenase IV
- Los 1 mg / ml in KSR medium door het plaatsen bij 37 ° C gedurende 1-2 uur of totdat alle poeder in oplossing gaat.
- Filter steriliseren.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-tribroomethanol
- 0,25 ml 2-methyl-2-butanol
- Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht op 100% oplossing te vormen.
- Enkele uren voor de operatie, verdund tot 2,5% werkende oplossing met behulp van DPBS en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur.
- Filter steriliseren en aliquot deel.
- Tribroomethanol is zeer licht-gevoelig, dus bescherming tegen licht in alle stadia van bereiding en het gebruik.
- Bereid niet meer dan 12-24 uur voor gebruik.
Buprenorfine
- 1 mg / ml stockoplossing in methanol
- Verdun tot 0,015 mg / ml werkoplossing met behulp van steriele H 2 O.
- Bewaren bij -20 ° C tot 1 maand.
Ketoprofen
- 0,5 mg / ml werkoplossing in DPBS
- Voeg DPBS, 's nachts bij 37 ° C incubeer gedurende 1-2 uur of totdat alle poeder in oplossing gaat.
- Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
Discussion
We hebben zich aangepast een zeer efficiënte teratoom formatie test voor het doel in kaart brengen van het lot van differentiatie hESC 's in een in vivo omgeving. Een klein aantal speciaal geselecteerde hESC 's wordt gemengd met ongedifferentieerde wild type hESC' s en Phaseolus vulgaris lectine in een cel pellet te vormen. Dit is geënt onder de nier capsule in een immunodeficiënte muis. Het lot van de oorspronkelijk geselecteerde hESC 's kan dan worden bepaald door immunohistochemie (figuur 5), zoals eerder gerapporteerd (9). Deze methode biedt een waardevol instrument voor het identificeren en het genereren van weefsel-specifieke reagentia voor cel-gebaseerde therapie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een uitgebreid onderzoek Grant van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RC1-00104), een Public Health Service Grant (HL085377) van NHLBI, en een geschenk van de Pollin Stichting HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
