Summary
Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole de
Abstract
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité illimitée de l'auto-renouvellement, et la capacité de se différencier en cellules provenant de chacun des trois feuillets embryonnaires (1). Différenciation dirigée des CSEh dans les types cellulaires spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt dans le domaine de la médecine régénérative (par exemple, (2-5)), et des méthodes pour la détermination de la
Protocol
Le protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publiés par les auteurs, avec quelques modifications. Le protocole est exécuté avec l'approbation par le soin des animaux UCSF institutionnels et d'utilisation (IACUC) et surveillance de la recherche sur les cellules souches (SCRO) Comités.
I. Culture des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh)
- Cultivez CSEh en standard à 6 puits (3,5 cm de diamètre des puits) plaques.
- Au moins 12 heures avant repiquage des cellules, fibroblastes de souris graines embryonnaires (MEF; obtenu à partir de CF1 jour E12.5 souris chronométrés-estimé, irradiés à 1000 Ci) cellules nourricières sur des plaques enduites de gélatine à 1% (6,7). FAE devrait être plaqué à 50-60% de confluence, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre ainsi (figure 1).
- Passage des cellules où les colonies ont atteint la confluence ~ 70% (figure 2).
- Pour le passage des cellules, la croissance moyenne aspirer KSR (6) dans les puits et les remplacer par 0,5 ml de milieu contenant de la collagénase IV dans KSR à une concentration de 1 mg / ml.
- Incuber les plaques avec de la collagénase IV à 37 ° C / 5% CO 2 pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que les bords des colonies commencent à soulever de la plaque.
- Retirez la collagénase IV de la plaque, ajoutez 0,5 ml de KSR dans chaque puits, et manuellement gratter les cellules à supprimer complètement de la plaque.
- Recueillir la suspension de cellules de chaque puits, placer dans un tube de 15 ml conique, et permettent aux cellules de se déposent par gravité pendant 5 minutes.
- Retirer le surnageant du tube, laissant les cellules et le milieu dans un volume total de ~ 300μl.
- L'utilisation d'un micro-200 pl pipeteur fixé à plein volume, délicatement la pipette la suspension de cellules 5-6 fois pour briser les colonies.
- Apportez la suspension cellulaire à un volume total de 9 ml par puits original de cellules en utilisant un milieu KSR (c'est à dire, si l'on est bien récolté, le tube doit contenir 9 ml). Supplément de la moyenne avec facteur humain recombinant fibroblastes de croissance basique (bFGF) à une concentration de 12,5 ng / ml.
- Après lavage des puits nouveaux contenant des cellules MEF (voir étape 2) avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) pour supprimer tous sérum, ajouter 3 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C CO / 5% 2.
- Changer moyennes KSR avec bFGF 24 heures après le passage, et toutes les 24-48 heures jusqu'à cellules sont prêtes à être repiquées à nouveau.
II. Préparation des CSEh granulés pour le greffage
- A 24 heures avant la greffe, ajouter l'inhibiteur ROCK au milieu KSR à une concentration finale de 10 uM d'augmenter la viabilité cellulaire (8). Un puits de cellules à confluence ~ 70% (5 x 10 5 cellules) va créer deux boulettes, avec deux pastilles inséré par capsule du rein.
- Pour préparer les culots de cellules à greffer (9), inhibiteur de ROCK incuber les cultures traitées avec de la collagénase IV pendant 5 minutes à 37 ° C CO / 5% 2.
- Aspirer le IV collagénase du puits et la remplacer par une DPBS ml avec 10% de pénicilline / streptomycine (stylo / STREP).
- Manuellement racler les colonies de la plaque, rincez le bien avec une 1 supplémentaires DPBS ml avec stylo / le streptocoque et le transfert de chaque aliquote de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation.
- Spin microtubes de 8000 x brièvement g, aspirer le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans DPBS 500μl avec stylo / streptocoque.
- Pour aider à lier les cellules entre elles pour une greffe, ajouter 100 ul 1 mg / ml de lectine de Phaseolus vulgaris (PHA) dans DPBS à chaque tube.
- Incuber les cellules / suspension de PHA à température ambiante pendant 5 minutes, puis tourner pendant 2 minutes à 8000 x g. Tournez les tubes de 180 ° dans leur puits de rotor et de spin à nouveau pendant 2 minutes à 8000 x g.
- Aspirer délicatement le surnageant en laissant intacte la pastille.
- Déloger les culots des tubes par un léger pipetage KSR 200 pl à côté de la bordure de la pastille jusqu'à ce qu'elle lève lentement.
- Une fois délogés, transférer immédiatement les pellets à 0.4μm inserts Millicell placés dans les puits 3,5 cm de diamètre contenant 3 ml KSR, et incuber pendant 2 heures pour une nuit à 37 ° C / 5% de CO 2.
III. Capsule rénale greffant
- Effectuez toutes les procédures animaux conformément aux lignes directrices institutionnelles en utilisant les règles d'asepsie.
- Anesthetize SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / LCR), âgés de 8-12 semaines, en utilisant une combinaison de 3% O2 inhalé isoflurane/0.5% et tribromoéthanol intrapéritonéale (Avertin; 25 mg / kg fraîchement préparé). Deux pastilles de cellules par souris seront greffées en utilisant des techniques décrites (10).
- Après avoir placé la souris sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie, raser la zone d'incision, puis désinfectez-les avec la chlorhexidine. Faire une incision de 2,5 cm par la peau juste à côté du centre, mais parallèle à la colonne vertébrale.
- Garder la zone d'incision humides avec des stériles Saline, faire une petite incision dans le muscle, juste en dessous des côtes et environ 1 cm de la colonne vertébrale. L'incision doit être juste assez grand pour tirer le rein à travers, mais assez petite pour que le rein ne sera pas retomber dans la cavité abdominale sans force.
- Tirez doucement le rein par l'incision musculaire en utilisant une pipette Pasteur en verre qui a été tiré dans la forme d'un brutal, un crochet légèrement incurvée.
- Mouiller le rein avec DPBS stérile pour empêcher la capsule de se dessécher. Cela peut être nécessaire de répéter toute la procédure, comme la capsule est très fragile.
- En utilisant une pince Dumont # 5, tirez doucement sur la capsule du rein et de faire une incision de 2 mm en utilisant des ciseaux à ressort Vannas.
- Avec une autre pipette en verre qui a été tiré dans une très fine, une sonde émoussé, faire une petite poche entre la capsule et le rein.
- Utiliser une pipette à grande orifice placé sur une pipette de transfert jetable, prenez une seule cellule de l'insert à granulés Millicell. Assurez-vous de prendre aussi peu médiatique supplémentaire tout au long que possible, que les médias en excès peut interférer avec le transfert de granulés.
- Tout en maintenant le bord de l'incision pour créer la pochette, placez doucement le culot à côté de l'ouverture et la pousser dans la poche vers un pôle du rein avec la pipette tiré.
- Répétez le processus avec une seconde boulette. Placez ce sous la capsule du rein même, mais vers le pôle opposé.
- Placez délicatement la capsule de retour vers le bas sur les pastilles. Les pellets doivent rester dans la poche, et pas de sutures sont nécessaires pour fermer la capsule.
- Poussez doucement le rein dans la cavité abdominale et près de la paroi musculaire utilisant des sutures de soie 4-0 (ou plus petit) avec joint inverse de coupe aiguille. L'incision doit être assez petit pour que seule une suture simple est nécessaire.
- Fermer la peau avec une série de 4-5 points de suture interrompue, en utilisant le matériel de suture mêmes.
- Avant de placer la souris de retour dans sa cage, administrer 0,05 mg / kg de buprénorphine (11,12) et 5 mg / kg de kétoprofène (12,13) que les analgésiques à court terme et à long terme, respectivement. Les substances contrôlées ne doivent être utilisés conformément aux directives institutionnelles.
- Transfert retour de l'animal dans sa cage et lui permettre de récupérer de l'anesthésie sur un coussin chauffant. Cela devrait prendre environ 20-30 minutes.
- Une fois que la souris est totalement ambulatoire, il peut être retourné à l'animalerie.
IV. La récolte tératome, la fixation et de sectionnement
- À 8-12 semaines post-chirurgie, il devrait y avoir un tératome peine palpable près du rein. Large, kystes remplis de liquide se développent souvent ainsi, à partir de 6-8 semaines. Ceux-ci peuvent nécessiter une récolte plus tôt si elles causent une détresse à l'animal. Depuis tératomes croître à un taux plus lent que les kystes, cependant, vous aurez envie d'attendre aussi longtemps que possible pour obtenir un tératome de taille suffisante pour l'analyse (c'est à dire, au moins 8 semaines).
- Retirez les reins, le tératome, et tout kystes entourant comme un bloc de tissu de la cavité abdominale utilisant la même approche chirurgicale par laquelle le rein a été consultée (voir Section III, les étapes 1-4 ci-dessus).
- Placez le bloc entier de tissu excisé dans un tube contenant 10% de formol tamponné.
- Laisser le tératome de fixer une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain, retirez le tératome du tube. Disséquer l'écart des kystes rénaux et autant que possible sans endommager le tératome lui-même (figure 3). Agrandir tératomes peuvent être coupées en deux pour faciliter la dissection et l'intégration.
- Traiter le tératome utilisant un standard de paraffine fixation technique. Unités automatiques sont disponibles (par exemple, Hypercenter Shandon):
I. 80% d'alcool Flex 2 heures II. 80% d'alcool Flex 1 heure III. 85% d'alcool Flex 1,5 heures IV. 95% d'alcool Flex 1 heure V. 100% d'alcool Flex 1 heure VI. 100% d'alcool Flex 1 heure VII. 100% d'alcool Flex 1 heure VIII. Clear-Rite 3 1 heure IX. Clear-Rite 3 1 heure X. Clear-Rite 3 1 heure XI. Paraffine (TissuePrep) 2 heures XII. Paraffine (TissuePrep) 2 heures
V. L'immunohistochimie et d'analyse
- Une fois incorporé dans de la paraffine, la section de 5 um tératome tranches série à l'aide d'un microtome rotatif, et les sections flottent sur des lames.
- Avant coloration, cuire les diapositives pour au moins une heure.
- Colorer les diapositives à l'hématoxyline et l'éosine en utilisant des méthodes standard pour identifier les structures des tissus représentant de chacun des trois feuillets embryonnaires (figure 4):
I. Lavez Xylène 3-5 minutes II. Xylène 3-5 minutes III. D'alcool à 100% 3-5 minutes IV. D'alcool à 100% 3-5 minutes V. 95% d'alcool 3-5 minutes VI. 80% d'alcool 3-5 minutes VII. L'eau de lavage (plusieurs changements) 2 minutes VIII. Gill hématoxyline # 3 2-5 minutes IX. L'eau de lavage (plusieurs changements) jusqu'à ce l'eau soit claire X. Scott eau (pour les noyaux en bleu) 3 minutes ou plus XI. L'eau de lavage (plusieurs changements) 1-2 minutes XII. Éosine Y 1 minute XIII. L'eau de lavage (plusieurs changements) 30 secondes XIV. 80% d'alcool 1 minute XV. 95% d'alcool 2 minutes XVI. 95% d'alcool 2 minutes XVII. D'alcool à 100% 3 minutes XVIII. 100% d'alcool (propre) 3 minutes XIX. Xylène 2 minutes ou plus XX. Xylène 2 minutes ou plus - Monter une lamelle sur chaque diapositive avec Permount.
VI. Les résultats représentatifs
Figure 1. Placage des fibroblastes de souris irradiées CF1 embryonnaires comme une couche nourricière pour les CSEh culture indifférencié. FAE sont plaqués au confluent ~ 50%, comme indiqué ici, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre bien dans une boîte de culture de 6 puits. Bar, 100 um.
Figure 2. CSEh exemple de la culture des CSEh indifférenciées subconfluentes sur une couche nourricière MEF. Sont cultivés sur des couches nourricières MEF jusqu'au confluent ~ 70%, comme indiqué ici, puis repiquées comme décrit. Bar, 100 um.
Figure 3. Exemple de tératomes explantés. Après explantation, le tératome, le rein, et tout tissu accessoires sont fixés comme un bloc dans le formol, puis les reins et les tissus accessoires sont soigneusement taillées loin avant enrobage dans la paraffine.
Figure 4. Tératomes dérivées de CSEh indifférenciées contiennent représentatifs des tissus de toutes les couches de germe de trois en vivo. Un tératome, comme celui représenté dans la figure 3, a été sectionné et colorées à l'hématoxyline et l'éosine pour identifier les tissus embryonnaires. CSEh donner lieu à des tissus provenant des trois feuillets embryonnaires (ectoderme (A, B), mésoderme (C), l'endoderme (D). (A) la structure naissante du tube neural. (B) épithélium primitif. (C) entouré par une capsule de cartilage du mésenchyme condensé. (D) la structure glandulaire intestinale. Bar, 100 um. Images reproduites avec l'autorisation de l'auteur.
Figure 5. Analyse tératome peut être utilisé pour cartographier le sort de étiquetés, CSEh indifférenciées. Comme précédemment publié (9), un mélange de CSEh spécifiquement marqués avec CSEh non marquées peuvent être utilisées pour cartographier le sort des cellules marquées dans un dosage de la formation de tératome. Comme le montre ici, CSEh indifférenciées exprimant le marqueur de surface, CD133, et étiqueté avec la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), ont été mélangés avec non balisés, CSEh indifférenciées. Ils ont été utilisés pour former des tératomes par capsule rénale greffe. L'analyse immunohistochimique de l'hématoxyline et l'éosine tératome sections colorées avec des anticorps anti-eGFP démontre le sort de l'neuroectodermique CD133 + CSEh. Tératomes ont été traitées comme dans la figure 4 et de contraste avec des anticorps anti-eGFP (marron) pour localiser des dérivés de cellules CD133 + cellules GFP + dans les tissus. CD133 + cellules dérivées (flèches) ont été observées dans les tissus provenant de l'ectoderme embryonnaire, l'épithélium spécifiquement neural (à gauche) et du tube neural naissante structures similaires (à droite). Bar, 100 um. Images reproduites avec l'autorisation de l'auteur.
Gélatine
- 0,1% gélatine porcine
- DPBS 99,9%
- Ajouter la gélatine au DPBS, incuber à 37 ° C pendant une heure ou jusqu'à ce que la gélatine tous les passe en solution, et stériliser par filtration (0.22μm) avant utilisation.
MEF moyennes
- 10% de sérum fœtal bovin (qualifié)
- Dulbecco 90% de modification Essential Medium (D-MEM)
- 1x L-Glutamine
- 1x Pen / Strep
- Stériliser par filtration avant l'utilisation.
KSR (Remplacement Knockout sérum) moyenne
- 20% de remplacement du sérum KnockOut
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-Glutamine
- 1x acides aminés non essentiels
- 0,1 mM β-mercaptoéthanol /
- 12,5 ng / ml de bFGF
- Stériliser par filtration.
- Conserver à 4 ° C, mais au chaud à 37 ° C avant d'ajouter aux cellules.
- Ajouter bFGF immédiatement avant utilisation.
Collagénase IV
- Dissoudre 1 mg / ml dans le milieu KSR en plaçant à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu'à ce que toute la poudre passe en solution.
- Stériliser par filtration.
Avertin
- 0,25 g de 2,2,2-tribromoéthanol
- 0,25 ml de 2-méthyl-2-butanol
- Incuber à 37 ° C pendant la nuit pour former une solution 100%.
- Plusieurs heures avant la chirurgie, une solution diluée à 2,5% de travail en utilisant DPBS et incuber à 37 ° C pendant au moins 1 heure.
- Filtre stériliser et aliquote.
- Tribromoéthanol est très sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière à toutes les étapes de préparation et d'utilisation.
- Préparer pas plus de 12-24 heures avant utilisation.
La buprénorphine
- 1 mg / ml de solution concentrée dans le méthanol
- Diluer à 0,015 mg / ml, solution de travail en utilisant stériles H 2 O.
- Conserver à -20 ° C jusqu'à un mois.
Le kétoprofène
- 0,5 mg / ml, solution de travail dans DPBS
- Ajouter DPBS, incuber une nuit à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu'à ce que toute la poudre passe en solution.
- Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
Discussion
Nous avons adapté un test de tératome très efficace de formation dans le but de cartographier le sort de différencier les CSEh dans un environnement in vivo. Un petit nombre de CSEh spécialement sélectionnés est mélangé avec indifférencié CSEh lectine de type sauvage et Phaseolus vulgaris pour former un culot cellulaire. Ceci est greffée sous la capsule rénale de souris immunodéficientes une. Le sort des CSEh initialement sélectionné peut alors être déterminé par immunohistochimie (figure 5), comme indiqué précédemment (9). Cette méthode fournit un outil précieux pour identifier et générer tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche global du California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), un Service de santé publique de subvention (HL085377) à partir du NHLBI, et un don de la Fondation Pollin à HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
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