Summary
Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung des
Abstract
Humane embryonale Stammzellen (hES) haben eine unbegrenzte Kapazität zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich in Zellen aller drei embryonalen Keimblätter (1) abgeleitet unterscheiden. Gerichtete Differenzierung von hES zu spezifischen Zelltypen hat viel Interesse im Bereich der regenerativen Medizin (z. B. (2-5)) erzeugt wird, und Methoden zur Bestimmung der
Protocol
Die schriftliche Protokoll unten auf der veröffentlichten Parametern von den Autoren berichteten, mit einigen Änderungen auf. Das Protokoll ist mit der Genehmigung durch die UCSF Institutional Animal Care und Use (IACUC) und Stammzellforschung Oversight (scro) Ausschüsse durchgeführt.
I. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES)
- Wachsen hESCs in Standard-6-well (3,5 cm Durchmesser Brunnen)-Platten.
- Mindestens 12 Stunden vor der Passage Zellen, Samen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF, erhalten ab CF1 Tag E12.5 timed-gepaart Mäuse, bei 1000 Ci bestrahlt) Feeder-Zellen auf Platten mit 1% Gelatine (6,7) beschichtet. MEFs sollte bei 50-60% Konfluenz oder 4 beschichtet werden x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser gut (Abbildung 1).
- Passage-Zellen, wenn Kolonien haben ~ 70% Konfluenz (Abbildung 2) erreicht.
- Um Passage der Zellen, absaugen KSR Wachstumsmedium (6) aus den Vertiefungen und ersetzen mit 0,5 ml Medium mit Collagenase IV in KSR bei einer Konzentration von 1 mg / ml.
- Die Platten mit Collagenase IV bei 37 ° C / 5% CO 2 für 5 Minuten oder bis Rändern der Kolonien beginnen, von der Platte zu heben.
- Entfernen Collagenase IV von der Platte, 0,5 ml KSR in jede Vertiefung und manuell kratzen Zellen vollständig von der Platte zu entfernen.
- Sammeln Sie die Zellsuspension aus jeder Vertiefung, in einem 15 ml konischen Rohr, und erlauben Zellen durch die Schwerkraft für 5 Minuten ruhen lassen.
- Entfernen Sie den Überstand aus der Röhre, so dass die Zellen und Medium in einem Gesamtvolumen von ~ 300μl.
- Mit einem 200 ul Mikro-Pipette eingestellt bei voller Lautstärke, sanft Pipette die Zellsuspension 5-6 mal die Auflösung der Kolonien.
- Bringen Sie die Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 9 ml pro Original gut von Zellen mit KSR Medium (dh, wenn man gut ist, geerntet werden, sollte das Röhrchen 9 ml enthalten). Supplement das Medium mit rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) auf eine Konzentration von 12,5 ng / ml.
- Nach dem Waschen der neue Brunnen mit MEF-Zellen (siehe Punkt 2) mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um alle Serum zu entfernen, 3 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C / 5% CO 2.
- Ändern KSR Medium mit bFGF 24 Stunden nach dem Durchgang, und jeder 24-48 Stunden, bis die Zellen bereit, wieder passagiert werden.
II. Vorbereitung der hESC Pellet für die Transplantation
- Nach 24 Stunden vor der Transplantation, fügen ROCK-Inhibitor, die KSR Medium bis zu einer Endkonzentration von 10 um, um die Lebensfähigkeit der Zellen (8) zu erhöhen. Ein gut von Zellen bei ~ 70% Konfluenz (5 x 10 5 Zellen) erzeugt zwei Pellets, mit zwei Pellets pro Nierenkapsel eingefügt.
- Zur Vorbereitung Zellpellets für die Transplantation (9), inkubieren ROCK-Inhibitor-behandelten Kulturen mit Collagenase IV für 5 Minuten bei 37 ° C / 5% CO 2.
- Saugen Sie die Collagenase IV aus dem Brunnen und ersetzen mit 1 ml DPBS mit 10% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep).
- Manuelles kratzen die Kolonien von der Platte, spülen Sie die auch mit einer zusätzlichen 1 ml DPBS mit Pen / Strep, und übertragen jeweils 1ml Aliquot der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Spin Mikrozentrifugenröhrchen kurz bei 8.000 x g, saugen Sie den Überstand und resuspendieren die Pellets in 500μl DPBS mit Pen / Strep.
- Um binden die Zellen für die Transplantation zusammen, fügen Sie 100 &mgr; 1 mg / ml Phaseolus vulgaris Lectin (PHA) in DPBS in jedes Röhrchen.
- Inkubieren der Zelle / PHA-Suspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten, dann für 2 Minuten bei 8.000 x g Spin. Drehen der Rohre um 180 ° in ihrem Rotor Brunnen und Spin wieder für 2 Minuten bei 8.000 x g.
- Vorsichtig absaugen Überstand Verlassen des Pellet intakt.
- Verdrängen die Zellpellets aus den Röhrchen durch vorsichtiges Pipettieren 200 ul KSR neben dem Rand des Pellet, bis sie hebt langsam.
- Sobald verdrängt, sofort in den Pellets zu 0.4μm Millicell Einsätze in 3,5 cm Durchmesser Brunnen mit 3 ml KSR gelegt, und inkubieren für 2 Stunden bis über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2.
III. Nierenkapsel Pfropfen
- Führen Sie alle tierischen Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter angemessenen aseptischen Bedingungen.
- Anesthetize SCID beige Mäusen (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / CRL), im Alter von 8-12 Wochen, mit einer Kombination von inhalativen 3% isoflurane/0.5% O2 und intraperitonealer Tribromethanol (Avertin, 25 mg / kg frisch zubereitet). Zwei Zellpellets pro Maus eingepflanzt Verwendung beschriebenen Techniken (10) werden.
- Nach der Platzierung der Maus auf ein Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern, rasieren Bereich des Einschnitts, dann desinfizieren mit Chlorhexidin. Machen Sie einen 2,5 cm Schnitt durch die Haut nur aus der Mitte, sondern parallel zur Wirbelsäule.
- Keeping the Einschnitt Bereich feucht mit steriler saline, einen kleineren Schnitt durch den Muskel, gerade unterhalb der Rippen und ~ 1 cm von der Wirbelsäule. Der Schnitt sollte gerade groß genug, um die Niere durch zu ziehen, aber klein genug, dass die Niere wird nicht wieder in die Bauchhöhle ohne Gewalt.
- Ziehen Sie die Niere vorsichtig durch den Muskel Schnitt mit einem Glas Pasteur Pipette, die in der Form eines stumpfen, leicht gebogene Haken gezogen worden ist.
- Wet die Niere mit steriler DPBS, um die Kapsel vor dem Austrocknen zu verhindern. Dies kann notwendig sein, um während des gesamten Verfahrens zu wiederholen, als die Kapsel ist sehr zerbrechlich.
- Mit Dumont Nr. 5 Pinzette vorsichtig die Kapsel aus der Niere und eine 2 mm Schnitt mit Vannas Frühjahr Schere.
- Mit einem weiteren Glaspipette, die in eine sehr feine, stumpfe Sonde gezogen worden ist, machen Sie eine kleine Tasche zwischen der Kapsel und der Niere.
- Mit einer großen Blende Pipettenspitze auf einem Einweg-Transferpipette platziert, nehmen Sie eine einzelne Zelle Pellet aus der Millicell einzufügen. Achten Sie darauf, möglichst wenig zusätzliche Medien zusammen wie möglich, wie überschüssige Medien mit dem Pellet Übertragung stören können.
- Halten Sie den Rand des Einschnitts, um die Tasche zu schaffen, ganz sanft das Pellet neben der Öffnung und schieben Sie sie in die Tasche zu einem Pol der Niere mit der Pipette gezogen.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit einem zweiten Pellets. Legen Sie diese unter der Kapsel der gleichen Niere, sondern auf dem entgegengesetzten Pol.
- Vorsichtig die Kapsel zurück auf die Pellets. Die Pellets sollen in der Tasche bleiben, und keine Nähte erforderlich sind, um die Kapsel zu schließen.
- Schieben Sie die Niere wieder in die Bauchhöhle und in der Nähe des Muskels Wand mit 4-0 Seidenfäden (oder kleiner) mit angeschlossenem Reverse-Schneidnadel. Der Schnitt sollte so klein sein, dass nur eine einzige Naht notwendig ist.
- Schließen Sie die Haut mit einer Reihe von 4-5 unterbrochen Stiche, mit dem gleichen Nahtmaterial.
- Bevor Sie mit der Maus zurück in seinen Käfig, verwalten 0,05 mg / kg Buprenorphin (11,12) und 5 mg / kg Ketoprofen (12,13) als kurzfristige und langfristige Analgetika bzw.. Geregelte Stoffe dürfen nur in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts verwendet werden.
- Übertragen Sie die Tiere wieder in seinen Käfig und lassen Sie sie aus der Narkose auf einem Heizkissen erholen. Dies sollte etwa 20-30 Minuten in Anspruch nehmen.
- Sobald die Maus ist voll gehfähig, kann es für das Tier Wohnanlage zurückgegeben werden.
IV. Teratom Ernte, Fixierung und Schneiden
- Bei 8-12 Wochen nach der Operation sollte es eine kaum spürbare Teratom in der Nähe der Niere. Large, mit Flüssigkeit gefüllte Zysten wird oft als gut entwickeln, beginnend bei 6-8 Wochen. Diese kann es erforderlich eine frühere Ernte, wenn sie Not, um das Tier zu verursachen. Da Teratome bei langsameren Raten als Zysten wachsen, jedoch werden Sie wollen so lange wie möglich warten, um ein Teratom von ausreichender Größe für die Analyse (dh mindestens 8 Wochen) zu erhalten.
- Entfernen Sie die Niere, Teratom, und alle umliegenden Zysten als ein Block von Gewebe aus der Bauchhöhle mit der gleichen chirurgischen Ansatz, bei dem die Nieren ursprünglich zugegriffen wurde (siehe Abschnitt III, die Schritte 1-4 oben).
- Platzieren Sie den gesamten Block von entfernten Gewebes in ein Röhrchen mit 10% gepuffertem Formalin.
- Lassen Sie das Teratom über Nacht fix bei 4 ° C.
- Am folgenden Tag, entfernen Sie das Teratom aus der Tube. Dissect weg keine Zysten und so viel Nieren wie möglich, ohne die Teratom selbst (Abbildung 3). Größere Teratome können in zwei Hälften geschnitten werden, um Dissektion und Einbettung zu erleichtern.
- Prozess der Teratom mit einem Standard-Paraffin-Verfahren zur Fixierung. Automatisierte Geräte sind (zB Shandon Hypercenter):
I. 80% Flex Alkohol 2 Stunden II. 80% Flex Alkohol 1 Stunde III. 85% Flex Alkohol 1,5 Stunden IV. 95% Flex Alkohol 1 Stunde V. 100% Flex Alkohol 1 Stunde VI. 100% Flex Alkohol 1 Stunde VII. 100% Flex Alkohol 1 Stunde VIII. Clear-Rite 3 1 Stunde IX. Clear-Rite 3 1 Stunde X. Clear-Rite 3 1 Stunde XI. Paraffin (TissuePrep) 2 Stunden XII. Paraffin (TissuePrep) 2 Stunden
V. Immunhistochemie und Analyse
- Einmal in Paraffin, Abschnitt der Teratom in 5 um serielle Scheiben mit einem Rotationsmikrotom und Float Schnitte auf Objektträgern eingebettet.
- Vor der Färbung, backen die Folien für mindestens eine Stunde.
- Stain die Folien mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardverfahren, um Gewebestrukturen Vertreter jeder der drei embryonalen Keimblätter (Abb. 4) zu identifizieren:
I. Xylol waschen 3-5 Minuten II. Xylol 3-5 Minuten III. 100% Alkohol 3-5 Minuten IV. 100% Alkohol 3-5 Minuten V. 95% Alkohol 3-5 Minuten VI. 80% Alkohol 3-5 Minuten VII. Wasser waschen (mehrere Änderungen) 2 Minuten VIII. Gill Hämatoxylin # 3 2-5 Minuten IX. Wasser waschen (mehrere Änderungen) bis das Wasser klar X. Scott ist Wasser (blau Kerne) 3 Minuten oder mehr XI. Wasser waschen (mehrere Änderungen) 1-2 Minuten XII. Eosin Y 1 Minute XIII. Wasser waschen (mehrere Änderungen) 30 Sekunden XIV. 80% Alkohol 1 Minute XV. 95% Alkohol 2 Minuten XVI. 95% Alkohol 2 Minuten XVII. 100% Alkohol 3 Minuten XVIII. 100% Alkohol (clean) 3 Minuten XIX. Xylol 2 Minuten oder mehr XX. Xylol 2 Minuten oder mehr - Montieren Sie ein Deckglas auf jeder Folie mit Permount.
VI. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Plating bestrahlter CF1 embryonalen Maus-Fibroblasten als Feeder-Schicht für die Kultivierung undifferenzierter hESCs. MEFs sind bei ~ 50% Konfluenz vernickelt, wie hier gezeigt, oder 4 x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser und in einer 6-well Kulturschale. Bar, 100 um.
Abbildung 2. Beispiel subkonfluenten Kultur von undifferenzierten hESCs auf einem MEF Feeder-Schicht. HESCs auf MEF Feederschichten bis ~ 70% konfluent gewachsen, wie hier gezeigt, dann passagiert, wie beschrieben. Bar, 100 um.
Abbildung 3. Beispiel explantierten Teratome. Nach der Explantation, die Teratom-, Nieren-und Zubehörteilen Gewebe als ein Block in Formalin fixiert, dann die Nieren-und Zubehör-Gewebe werden sorgfältig entfernt, bevor die Einbettung in Paraffin geschnitten.
Abbildung 4. Teratome aus undifferenzierten hESCs abgeleitet enthalten Gewebe Vertreter aller drei Keimblätter in vivo. Ein Teratom, wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, embryonale Gewebe zu identifizieren. hESCs führen zu Gewebe aller drei embryonalen Keimblätter (Ektoderm (A, B), Mesoderm (C), Endoderm abgeleitet (D). (A) Nascent Neuralrohr Struktur. (B) Primitive Plattenepithel. (C) Knorpelschäden Kapsel der kondensierten Mesenchym umgeben. (D) Glandular Darm-Struktur. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt.
Abbildung 5. Teratom Analyse kann verwendet werden, um das Schicksal der markierten, undifferenzierte hES Karte sein. Wie bereits veröffentlicht (9), eine Mischung aus speziell markiert hESCs mit untagged hESCs verwendet werden, um das Schicksal der markierten Zellen in ein Teratom-Assay Karte. Wie hier gezeigt wurden undifferenzierte hES Ausdruck der Oberfläche Marker CD133 und markiert mit Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP), mit untagged, undifferenzierte hES gemischt. Diese wurden verwendet, um Teratome von Nierenkapsel Pfropfen bilden. Immunhistochemische Analyse der Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Teratom Abschnitte mit anti-eGFP-Antikörper zeigt die neuroektodermalen Schicksal der CD133 + hESCs. Teratome wurden wie in Abbildung 4 verarbeitet und gegengefärbt mit anti-eGFP-Antikörper (braun) zu lokalisieren Derivate von CD133 + GFP +-Zellen im Gewebe. CD133 +-abgeleiteten Zellen (Pfeile) wurden in den Geweben aus embryonalen Ektoderm, insbesondere neuronale Epithel (links) und im Entstehen begriffenen Neuralrohr-ähnlichen Strukturen (rechts) beobachtet. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt.
Gelatine
- 0,1% Gelatine vom Schwein
- 99,9% DPBS
- Add Gelatine DPBS, bei 37 ° C für eine Stunde oder bis alle Gelatine in Lösung geht und Filter sterilisieren (0,22 &mgr; m) vor dem Gebrauch zu inkubieren.
MEF-Medium
- 10% fötalem Rinderserum (qualifiziert)
- 90% Dulbecco Modified Essential Medium (D-MEM)
- 1x L-Glutamin
- 1x Pen / Strep
- Filter vor Gebrauch zu sterilisieren.
KSR (Knockout Serum Replacement) Medium
- 20% KnockOut Serum Ersatz
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-Glutamin
- 1x nicht essentielle Aminosäuren
- 0,1 mM β-Mercaptoethanol /
- 12,5 ng / ml bFGF
- Filter sterilisieren.
- Lagerung bei 4 ° C, aber warm bis 37 ° C vor der Zugabe zu den Zellen.
- Add bFGF unmittelbar vor dem Gebrauch.
Collagenase IV
- 1 mg / ml in KSR Medium, indem bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht.
- Filter sterilisieren.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-Tribromethanol
- 0,25 ml 2-Methyl-2-Butanol
- Bei 37 ° C über Nacht auf 100% ig.
- Einige Stunden vor der Operation, zu verdünnen, um 2,5% funktionierende Lösung mit DPBS und bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde.
- Filter sterilisieren und aliquote.
- Tribromethanol ist sehr lichtempfindlich, so vor Licht zu schützen in allen Phasen der Herstellung und Verwendung.
- Bereiten Sie nicht mehr als 12-24 Stunden vor dem Gebrauch.
Buprenorphin
- 1 mg / ml Stammlösung in Methanol
- Verdünnen auf 0,015 mg / ml Arbeitslösung mit sterilem H 2 O.
- Lagerung bei -20 ° C bis zu 1 Monat.
Ketoprofen
- 0,5 mg / ml Arbeitslösung in DPBS
- Add DPBS inkubieren über Nacht bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht.
- Filter sterilisiert und bei 4 ° C.
Discussion
Wir haben eine hocheffiziente Teratom-Assay für die Zwecke der Kartierung das Schicksal der Differenzierung hESCs in einem In-vivo-Umgebung angepasst. Eine kleine Anzahl von speziell ausgewählten hESCs ist mit undifferenzierten Wildtyp hESCs und Phaseolus vulgaris Lectin ein Zellpellet vermischt. Dies ist unter der Nierenkapsel in einem immundefizienten Maus gepfropft. Das Schicksal der ursprünglich ausgewählten hESCs dann durch Immunhistochemie (Abbildung 5) bestimmt werden, wie bereits berichtet (9). Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die Identifizierung und Generierung Gewebe-spezifische Reagenzien für zell-basierte Therapien.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein umfassendes Research Grant aus dem California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), eine Public Health Service Grant (HL085377) aus NHLBI, und ein Geschenk aus dem Pollin-Stiftung unterstützt HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
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