Summary
特定の細胞へのヒトES細胞の監督分化、再生医療に大きな関心を生成しています。我々は決定するための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供する
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）は、自己複製のための無制限の容量、および3つのすべての胚性生殖層（1）に由来する細胞に分化する能力を持っている。特定の細胞型へのヒトESの指示分化、再生医療（例えば、（2-5））、及び決定するための方法の分野で大きな関心を生成しています
Protocol
以下の書面によるプロトコルはいくつかの修正と、著者らによって報告された公開パラメータに基づいています。プロトコルは、UCSF動物実験の使用（IACUC）と幹細胞研究の監督（SCRO）委員会による承認を得て実行されます。
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）のI.の文化
- 標準の6ウェル（3.5直径2cm井戸）プレートにヒトES細胞を成長する。
- 少なくとも12時間前の継代細胞、種子のマウス胚性線維芽細胞（MEF; CF1日E12.5タイムアウトした交配マウスから得られた、1000 Ciので照射）〜1％ゼラチン（6,7）でコーティングしたプレート上にフィーダー細胞。 MEFの50〜60％コンフルエント、またはよく3.5センチメートルの直径あたり4 × 10 5個の細胞（ 図1）で播種してください。
- パッセージのコロニーが〜70％コンフルエント（ 図2）に達している細胞。
- 継代の細胞を、吸引KSRの成長の井戸から培地（6）および1 mg / mlの濃度でKSRのコラゲナーゼIVを含む0.5 mlの培地に交換してください。
- 37コラゲナーゼIVでプレートをインキュベート° C / 5％は5分間またはコロニーの端までのCO 2は、プレートから持ち上げて始める。
- プレートからコラゲナーゼIVを削除、各ウェルにKSRの0.5 mlを追加し、手動で完全に板から削除するには、細胞をこすり落とす。
- 15 mlコニカルチューブの各ウェル、場所から細胞懸濁液を収集し、そして細胞は5分間重力によって解決することができます。
- 〜300μlの総体積で細胞と培地を残して、チューブから上清を取り除く。
- コロニーを分割するために5〜6回穏やかに細胞懸濁液をピペット、フルボリュームで200μlのマイクロピペッターセットを使用する。
- KSRの培地を用いて細胞の元よくあたり9 mlの全体積に細胞懸濁液をもたらす（ すなわち 、一方がよく収穫されている場合、チューブが9 mlを含める必要があります）。 12.5 ng / mlの濃度に組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）と培地を補足するものです。
- ダルベッコのリン酸とMEF細胞を（ステップ2を参照）を含む新たな井戸を洗浄した後、すべての血清を除去する各ウェルに細胞懸濁液の3mlを追加し、37℃/ 5％CO 2でプレートをインキュベートする（DPBS）緩衝生理食塩水。
- 細胞は再び継代される準備が整うまで、bFGFを通過後、24時間、およびすべての24〜48時間でKSRの培養液を交換する。
II。移植用のヒトES細胞ペレットの調製
- 移植の前に24時間で、細胞の生存率（8）を高めるために10μMの最終濃度にKSR媒体にROCK阻害剤を追加。 〜70％コンフルエント（5 × 10 5細胞）における細胞の1つのウェルは、腎被膜ごとに挿入された2つのペレットと、二つのペレットを作成します。
- （9）移植用細胞ペレットを準備するには、37℃で5分間コラゲナーゼIVとROCK阻害剤処理培養物をインキュベート℃/ 5％CO 2を 。
- 井戸からコラゲナーゼIVを吸引し、10％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）と1 mlのDPBSに置き換えます。
- 手動で、プレートからコロニーを削るペン/連鎖球菌でさらに1 mlのDPBSでよく洗い、そして1.5mlマイクロチューブに細胞懸濁液の各1ミリリットルアリコートを移す。
- 8000 × gで簡単にマイクロチューブをスピン、上清を吸引し、そしてペン/連鎖球菌と500μLDPBSでペレットを懸濁します。
- 移植のために一緒に細胞をバインドしやすくするために、各チューブにDPBSで100μlの1 mg / mLのインゲンマメレクチン （PHA）を追加します。
- 5分間室温でセル/ PHA懸濁液をインキュベートし、8000 × gで2分間スピン。そのローターのウェル内にチューブを180 °回転させ、8,000 × gで2分間、再度スピン。
- 慎重にペレットはそのままにして上清を吸引除去する。
- それはゆっくりと持ち上げるまでゆっくりペレットの端の隣に200μlのKSRをピペッティングによりチューブからの細胞ペレットを押しのける。
- 一度外れたりし、すぐに3 mlのKSRのかの3.5 cmの直径のウェルに配置0.4μmMILLICELLインサートにペレットを移し、37℃/ 5％CO 2で一晩に2時間インキュベートする。
III。移植腎被膜
- 適切な無菌操作を用いて、機関のガイドラインに従い、すべての動物の手順を実行します。
- （、25 mg / kgのは作りたてのAVERTIN）吸入3パーセントisoflurane/0.5％のO2と腹腔内ブロムエタノールの組み合わせを使用して、8-12週齢のSCIDベージュマウス（CB17.Cg - Prkdc SCID Lyst BG / CRL）が、麻酔。マウス当たり2個の細胞ペレットを、説明するテクニック（10）を使用して生着されます。
- 低体温症を防ぐために加熱パッド上でマウスを配置した後、切開面積を剃る、その後クロルヘキシジンでそれを駆除。ちょうど背骨の中心が平行から皮膚を通して2.5cmの切開を行います。
- 無菌サリンと切開面積が湿った状態に保つeは、ちょうど肋骨と背骨から〜1センチメートルの下に、筋肉を通して小さな切開を行います。切開はを通じて腎臓を引くのに十分な大きさの、しかし、腎臓は力なく、腹腔内に戻ってスリップしないように十分小さくする必要があります。
- 鈍、わずかに湾曲したフックの形状に反映されたガラスパスツールピペットを用いて筋肉を切開して静かに腎臓を引き出します。
- 腎臓は、乾燥からカプセルを防ぐために滅菌DPBSで濡らす。これは、カプセルは非常に壊れやすいように、プロシージャ全体で繰り返す必要があります。
- デュモン＃5ピンセットを使用して、静かに腎臓からカプセルを引き上げ、Vannasの春のはさみを使用して2 mmの切開を行います。
- 非常に細かい、平滑化プローブに引き込まれている別のガラスピペットで、カプセルと腎臓の間に小さなポケットを作る。
- 使い捨て転送ピペット上に置か大型オリフィスのピペットチップを使用して、MILLICELLインサートから単一の細胞ペレットをとる。余分なメディアは、ペレットの転送を妨げることができるよう、可能な限り一緒に少し余分なメディアとして活用することを確認してください。
- ポケットを作成するために切開の端を押さえながら、ゆっくりと開口部に横にペレットを配置し、引っ張らピペットと腎臓の一方の極に向かってポケットに押し込みます。
- 第二ペレットを使用してプロセスを繰り返します。同じ腎臓の被膜下にこれを置くのではなく、その反対の極に向かって。
- ペレットに戻ってダウンカプセルに静かに置きます。ペレットは、ポケットの範囲内に収める必要があります、とは縫合糸は、カプセルを閉じる必要がありません。
- ゆっくりと腹腔内に戻って腎臓を押し、接続された逆カッティング針を4から0絹縫合糸（または小さい）を使用して筋肉の壁を閉じます。切開は、単一の縫合が必要であることを十分小さくする必要があります。
- 同じ縫合材料を使用して、4-5中断ステッチのシリーズで皮膚を閉じます。
- そのケージに戻ってマウスを配置する前に、それぞれ、短期的および長期的な鎮痛剤として0.05 mg / kgをブプレノルフィン（11,12）及び5 mg / kgのケトプロフェン（12,13）を管理する。規制物質は、唯一の制度ガイドラインに従って使用されるべきである。
- そのケージに戻って動物を転送し、加熱パッド上で麻酔から回復することができます。これは、20〜30分ほどかかります。
- マウスは完全に歩行可能になると、それは、動物飼育設備に戻すことができます。
IV。奇形腫の収穫、固定とセクショニング
- 8-12週後の手術で、腎臓の近くにかろうじて触知奇形腫があるはずです。大規模な、液体で満たされた嚢胞はしばしば6-8週間で始まる、同様に開発する。彼らは動物に苦痛を引き起こす場合、これらは以前の収穫が必要になる場合があります。奇形腫は嚢胞よりも遅い速度で成長するので、ただし、解析に十分な大きさ（ すなわち 、少なくとも8週間）の奇形腫を得ることできるだけ長く待つことになるでしょう。
- 腎臓、奇形腫、および腎臓が最初にアクセスされたことによって、同じ外科的アプローチを用いて腹腔から組織のブロックなどの周囲の嚢胞を削除する（セクションIII、上記の手順1-4を参照）。
- 10％の緩衝ホルマリンを含むチューブに切除した組織の全体のブロックを置きます。
- 奇形腫は、4℃で一晩固定することができます℃を
- 翌日、チューブから奇形腫を取り除く。奇形腫自体（ 図3）を損傷することなく、任意の嚢胞や、できるだけ多くの腎臓を離れて分析する。大きな奇形腫は、解剖や埋め込みを容易にするために半分にカットされることがあります。
- 標準的なパラフィン固定法を使用して奇形腫を処理します。自動化されたユニット（ 例えば 、シャンドンのHypercenter）利用可能です。
I. 80パーセントフレックスアルコール 2時間 II。 80パーセントフレックスアルコール 1時間 III。 85パーセントフレックスアルコール 1.5時間 IV。 95パーセントフレックスアルコール 1時間 V. 100パーセントフレックスアルコール 1時間 VI。 100パーセントフレックスアルコール 1時間 VII。 100パーセントフレックスアルコール 1時間 VIII。 クリアライト3 1時間 IX。 クリアライト3 1時間 X. クリアライト3 1時間 XI。 パラフィン（TissuePrep） 2時間 XII。 パラフィン（TissuePrep） 2時間
V.免疫組織化学および分析
- 一度スライド上にパラフィン、セクションロータリーミクロトームを用いて5μmのシリアルスライスにおける奇形腫、およびfloat型のセクションに埋め込まれています。
- 染色する前に、少なくとも1時間のためのスライドを焼く。
- three胚性生殖層（ 図4）のそれぞれの代表的な組織構造を識別するための標準的な方法を使用してヘマトキシリンとエオシンでスライドを染色。
I. キシレン洗浄 3〜5分 II。 キシレン 3〜5分 III。 100％アルコール 3〜5分 IV。 100％アルコール 3〜5分 V. 95％アルコール 3〜5分 VI。 80％アルコール 3〜5分 VII。 水の洗浄（いくつかの変更） 2分 VIII。 ギルのヘマトキシリン第3位 2-5分 IX。 水の洗浄（いくつかの変更） 水は明らかに実行されるまで X. スコットの水（青色の核へ） 3分以上 XI。 水の洗浄（いくつかの変更） 1〜2分 XII。 エオシンY 1分 XIII。 水の洗浄（いくつかの変更） 30秒 XIV。 80％アルコール 1分 XV。 95％アルコール 2分 XVI。 95％アルコール 2分 XVII。 100％アルコール 3分 XVIII。 100％のアルコール（クリーン） 3分 XIX。 キシレン 2分以上 XX。 キシレン 2分以上 - Permountと各スライドにカバースリップをマウントします。
VI。代表的な結果
図1。培養未分化ヒトES細胞のフィーダー層として照射したCF1マウス胚線維芽細胞のメッキ。MEFのは〜50％コンフルエントで播種されていますが、以下に示すように、または6ウェル培養皿でも3.5センチメートルの直径ごとに4 × 10 5細胞。バー、100μmである。
図2。ここに示されているようにMEFフィーダー層上で未分化ヒトES細胞のサブコンフルエントの文化の一例。ヒトES細胞は、〜70％コンフルエントになるまでMEFフィーダー層上に成長され、その後、前述のように継代。バー、100μmである。
図3。外植奇形腫の一例を。植後、奇形腫、腎臓、および付属品の組織をホルマリンでブロックに固定され、その後、腎臓やアクセサリーの組織は、慎重にパラフィン中に埋め込 む前に離れてトリミングされます。
図4。未分化ヒトES細胞から派生した奇形腫は、生体内でのすべての三胚葉の組織の代表者が含まれています。このような図3に示すものと奇形腫は、胚組織を識別するために、切片化し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。ヒトES細胞は、3つのすべての胚性胚葉（外胚葉（A、B）、中胚葉（C）、内胚葉由来の組織を生じさせる（D）。 （A）新生神経管の構造を。 （B）プリミティブ扁平上皮。 （C）軟骨は、凝縮間充織のカプセルに囲まれています。 （D）腺腸の構造。バー、100μmである。画像は、作者の許可を得て転載。
図5。奇形腫の解析は、タグ付き、未分化ヒトES細胞の運命をマッピングするために使用することができます。以前に発表されたように（9）、タグの付いていないヒトES細胞と特異的にタグ付けされたヒトES細胞の混合物は、奇形腫形成アッセイでタグ付けされた細胞の運命をマッピングするために使用することができます。ここに示すように、表面マーカー、CD133、および強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）でタグ付けさを表現する未分化ヒトES細胞は、タグなし、未分化ヒトES細胞と混合した。これらは、移植腎被膜で奇形腫を形成するために使用された。抗- EGFP抗体とヘマトキシリンおよびエオシン染色した奇形腫切片の免疫組織化学分析は、CD133 +のヒトESの神経外胚葉の運命を示しています。奇形腫は、 図4のように処理され、組織内でCD133 + GFP +細胞の誘導体をローカライズするために、抗- EGFP抗体（ 茶色 ）で対比染色した。 CD133 +由来細胞（ 矢印 ）胚外胚葉、特に神経上皮（ 左 ）と発生期神経管様構造（ 右 ）から生じる組織で観察された。バー、100μmである。画像は、作者の許可を得て転載。
ゼラチン
- 0.1パーセントブタゼラチン
- 99.9％のDPBS
- ° C（0.22μm）1時間またはすべてのゼラチンが溶液になるまで、そしてフィルタは殺菌使用前に37℃でインキュベートDPBS、のゼラチンを追加します。
MEF培地
- 10％ウシ胎児血清（修飾）
- 90パーセントダルベッコ改変必須培地（D - MEM）
- 1 × L -グルタミン
- 1Xペン/連鎖球菌
- 使用前に滅菌をフィルタリング。
KSR（ノックアウト血清代替）培地
- 20％ノックアウト血清代替物
- 80％のノックアウトD - MEM
- 1 × L -グルタミン
- 1 ×非必須アミノ酸
- 0.1mMのβ-メルカプトエタノール/
- 12.5 ng / mlのbFGFを
- 滅菌フィルタします。
- 4℃、ただし37℃くらいまで温め、細胞に添加する前に。
- 使用直前にbFGFを追加します。
コラゲナーゼIV
- すべての粉体が溶液になるまで1〜2時間または、37℃で配置することで、KSRの培地で1 mg / mlを溶解する。
- 滅菌フィルタします。
AVERTIN
- 0.25グラム2,2,2 - トリブロムエタノール
- 0.25ミリリットル2 - メチル-2 - ブタノール
- 37℃で100％の溶液を形成するために一晩。
- 手術前の数時間、37℃でDPBSとインキュベートを使用して希釈〜2.5％ワーキングソリューション℃で少なくとも1時間C。
- 滅菌、アリコートフィルタリング。
- トリブロムエタノールは非常に光に敏感なので、製造及び使用のすべての段階で光から保護する。
- 使用前にこれ以上の12から24以上の時間を準備します。
ブプレノルフィン
- メタノールで1 mg / mlのストック溶液
- 滅菌H 2 Oを用いて0.015 mg / mlの希釈標準溶液に希釈し
- 1ヶ月間まで、-20℃で保存する。
ケトプロフェン
- DPBSでは0.5 mg / mlの希釈標準溶液
- 、DPBSを追加で37一晩インキュベート℃で1-2時間またはすべての粉体が溶液になるまでは。
- 滅菌濾過し、4℃で保存します。
Discussion
我々は、 生体内環境でのヒトES細胞の分化運命をマッピングするの目的のために非常に効率的テラトーマ形成アッセイを適応している。特に選択されたヒトES細胞の少数は、細胞ペレットを形成するために未分化野生型のヒトESおよびインゲンマメのレクチンと混合される。これは、免疫不全マウスの腎被膜下にグラフトされています。最初に選択したヒトES細胞の運命は、そして、以前に（9）報告、（ 図5）免疫組織化学により決定することができる。このメソッドは、セルベースの治療のための組織特異的な試薬を識別し、生成するための貴重なツールを提供しています。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（RC1 - 00104）、NHLBIから公衆衛生サービスグラント（HL085377）、およびHSBへポリン財団からの贈り物から包括的な研究助成金によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
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