Summary
Направленной дифференцировки ЭСК в специфические клетки вызвал большой интерес в регенеративной медицине. Мы предоставляем краткие, шаг за шагом протокол для определения
Abstract
Человека эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают неограниченной способностью к самообновлению, и способность дифференцироваться в клетки, полученные из всех трех эмбриональных зародышевых листков (1). Направленной дифференцировки ЭСК в специфические типы клеток вызвало большой интерес в области регенеративной медицины (например, (2-5)), и методы определения
Protocol
Письменный протокол ниже, основывается на опубликованных параметров сообщают авторы, с некоторыми изменениями. Протокола осуществляется с одобрения UCSF Институциональные уходу и использованию животных (IACUC) и Исследования стволовых клеток надзора (SCRO) комитетов.
I. культуры человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)
- Расти ЭСК в стандартной 6-а (3,5 см в диаметре скважин) пластин.
- По крайней мере за 12 часов до пассажей клеток, семян мышиных эмбриональных фибробластов (MEF, полученные из CF1 день e12.5 приурочен-лых мышей, облученных при 1000 Ки) фидерных клеток на пластинах покрыта 1% желатина (6,7). MEFs должны быть покрыты на 50-60% слияния, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре скважины (рис. 1).
- Прохождение клеток при колонии достигла ~ 70% слияния (рис. 2).
- Для прохождения клетки, аспирацию роста KSR среды (6) из колодцев и заменить с 0,5 мл среды, содержащей коллагеназы IV в KSR при концентрации 1 мг / мл.
- Инкубируйте пластин с коллагеназы IV при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 5 минут или пока края колонии начинают снять с плиты.
- Удалить коллагеназы IV от плиты, добавить 0,5 мл KSR в каждую лунку, так и вручную очистить клетки, чтобы полностью удалить из пластины.
- Сбор клеточной суспензии из каждой лунки, место в 15 мл коническую трубку, и позволяют клеткам урегулировать под действием силы тяжести в течение 5 минут.
- Удалить супернатант из трубки, в результате чего клетки и среды в общем объеме 300 мкл ~.
- Использование 200 мкл микро-дозаторов устанавливается в полном объеме, аккуратно пипеткой клеточной суспензии 5-6 раза, чтобы разбить колоний.
- Принесите клеточной суспензии с общим объемом 9 мл на оригинальные и ячеек с помощью KSR среде (то есть, если один хорошо собирается, трубка должна содержать 9 мл). Дополнение среде с рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (bFGF) до концентрации 12,5 нг / мл.
- После мытья новых скважин содержащих MEF клеток (см. шаг 2) с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS), чтобы удалить все сыворотки, добавляют 3 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать пластин при 37 ° C / 5% СО 2.
- Изменение KSR среде с bFGF 24 часов после прохода, и каждые 24-48 часов, пока клетки готовы к пассировать еще раз.
II. Подготовка чЭСК гранулы для пересадки
- На 24 часов до пересадки, добавьте ROCK ингибитор KSR средней конечной концентрации 10 мкм увеличить жизнеспособность клеток (8). Одним из хорошо клеток на ~ 70% слияния (5 х 10 5 клеток) приведет к созданию двух гранул, с двумя гранулы вставляется в почечную капсулу.
- Для подготовки клетка таблеток для пересадки (9), инкубировать ROCK ингибитор обработанных культур с коллагеназы IV в течение 5 минут при 37 ° C / 5% СО 2.
- Аспирируйте коллагеназы IV из колодца и заменить с 1 DPBS мл с 10% пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк).
- Вручную очистить колоний от пластины, полоскание хорошо с дополнительно 1 мл DPBS пером / стрептококк, и передача каждого 1 мл аликвоту суспензии клеток в 1,5 трубки микроцентрифужную мл.
- Спиновые микроцентрифужную труб кратко в 8000 х г, аспирация супернатант, и ресуспендируют гранул в 500 мкл DPBS пером / стрептококк.
- Чтобы помочь связывают клетки между собой для трансплантации, добавьте 100 мкл 1 мг / мл Phaseolus обыкновенная лектина (PHA) в DPBS в каждую пробирку.
- Инкубируйте клетки / PHA суспензии при комнатной температуре в течение 5 минут, затем спина в течение 2 минут при 8000 х г. Поворот трубы на 180 ° в пределах их ротора скважин и спина снова в течение 2 минут при 8000 х г.
- Тщательно аспирата супернатант оставляя осадок нетронутыми.
- Выбить ячейки гранул из трубы, осторожно пипеткой 200 мкл KSR рядом с краем гранул, пока она медленно поднимается.
- Как только смещаются, немедленно передать гранулы 0.4μm MILLICELL вставки помещается в 3,5 см в диаметре скважин, содержащий 3 мл KSR, и выдержать в течение 2 часов ночи при 37 ° C / 5% СО 2.
III. Почечная капсула прививки
- Выполнение всех животных процедур в соответствии с руководящими принципами институциональной с использованием соответствующих правил асептики.
- Обезболить SCID бежевый мышей (CB17.Cg-Prkdc SCID лизатора BG / CRL), в возрасте 8-12 недель, используя сочетание ингаляционных 3% isoflurane/0.5% O2 и внутрибрюшинного tribromoethanol (Avertin; 25 мг / кг свежеприготовленный). Две ячейки гранул на мышь будет привита использованием описанных техник (10).
- После размещения мыши на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение, побриться области разреза, то вылечить хлоргексидином. Сделать 2,5 см разрез через кожу недалеко от центра, но параллельно позвоночнику.
- Хранение влажного области разреза стерильным Салине, сделать меньше разрез через мышцу, чуть ниже ребер и ~ 1 см от позвоночника. Разреза должна быть достаточно большой, чтобы тянуть через почки, но мало, что почки не скользят обратно в брюшную полость без применения силы.
- Вытяните почек мягко через разрез мышцы с помощью стеклянной пипетки Пастера, который был втянут в форме тупого, слегка изогнутые трубки.
- Влажные почек стерильным DPBS для предотвращения капсулы от высыхания. Это может быть необходимо повторять на протяжении всей процедуры, так как капсула очень хрупкая.
- Использование Дюмон # 5 пинцетом, осторожно потяните капсулы по сравнению с почками и сделать 2 мм разрез с помощью ножниц Vannas весной.
- С другой стеклянной пипетки, которые были втянуты в очень тонкий, притупляются зонд, сделайте небольшой карман между капсулой и почек.
- Использование большого отверстия пипетки помещают на одноразовые пипетки передачи, принять единый клеточный осадок от вставки MILLICELL. Убедитесь в том, чтобы занять всего лишь дополнительные средства массовой информации по возможности, как избыток средств массовой информации может помешать передаче гранул.
- Удерживая до края разреза, чтобы создать карман, осторожно положите шарик рядом с открытия и столкнуть ее в карман к одному полюсу почки с вытащил пипетки.
- Повторите процесс со второй гранул. Место это под капсулой из другого теста, а на противоположном полюсе.
- Осторожно поместите капсулу обратно вниз на гранулы. Гранулы должны оставаться в пределах кармана, а не швы необходимо закрыть капсулы.
- Аккуратно нажмите почек обратно в брюшную полость и закрыть мышц стене с помощью 4-0 швов шелк (или меньше) с прикрепленными обратного резки иглы. Разрез должен быть достаточно небольшим, что только один шов необходимо.
- Закрыть кожи серии 4-5 прервал стежки, используя те же шовный материал.
- Перед размещением мышь обратно в свою клетку, администрирования 0,05 мг / кг бупренорфин (11,12) и 5 мг / кг кетопрофен (12,13) в качестве краткосрочных и долгосрочных анальгетики, соответственно. Регулируемые вещества должны использоваться только в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Передача животных обратно в клетку и дать ему оправиться от наркоза на грелку. Это должно занять около 20-30 минут.
- Как только мышь полностью амбулаторно, оно может быть возвращено на объект жилищного животного.
IV. Тератома сбора, фиксации и секционирования
- В 8-12 недель после операции, не должно быть едва ощутимыми тератома возле почек. Большие, наполненные жидкостью кисты часто будет развиваться, а, начиная с 6-8 недель. Эти могут потребовать ранее урожай, если они причиняют страдания животным. С тератомы расти более медленными темпами, чем кисты, однако, вам нужно будет ждать столько, сколько можно получить тератома достаточного размера для анализа (то есть, по крайней мере 8 недель).
- Удаление почки, тератома, и любой окружающий кисты в виде блока ткани из брюшной полости с использованием тех же хирургических подход, при котором почка была первоначально доступ (см. раздел III, пункты 1-4 выше).
- Место весь блок вырезали ткани в пробирку, содержащую 10% буферный формалин.
- Разрешить тератома исправить течение ночи при 4 ° C.
- На следующий день, удалить тератомы из тюбика. Рассеките от любых кист и столько почек, возможно, не повреждая тератома себя (рис. 3). Большие тератомы могут быть сокращены в два раза для облегчения рассечения и вложение.
- Процесс тератома с использованием стандартного парафином фиксации техники. Автоматизированные устройства доступны (например, Shandon Гиперцентр):
I. 80% алкоголя Flex 2-х часов II. 80% алкоголя Flex 1 час III. 85% алкоголя Flex 1,5 часа IV. 95% алкоголя Flex 1 час V. 100% Flex алкоголя 1 час VI. 100% Flex алкоголя 1 час VII. 100% Flex алкоголя 1 час VIII. Открытый-Rite 3 1 час IX. Открытый-Rite 3 1 час X. Открытый-Rite 3 1 час XI. Парафин (TissuePrep) 2-х часов XII. Парафин (TissuePrep) 2-х часов
В. Immunohistochemistry и анализ
- Как только в парафин, раздел тератома в 5 мкм серийный ломтики с помощью роторного микротома, и плавать разделы на слайдах.
- Перед окрашиванием, испечь слайды, по крайней мере один час.
- Пятно слайды гематоксилином и эозином с использованием стандартных методов выявления тканевых структур представителю от каждой из трех эмбриональных зародышевых листков (рис. 4):
I. Ксилол мыть 3-5 минут II. Ксилол 3-5 минут III. 100% спирта 3-5 минут IV. 100% спирта 3-5 минут V. 95% алкоголя 3-5 минут VI. 80% алкоголя 3-5 минут VII. Вода мытья (несколько изменений) 2 минуты VIII. Гилл гематоксилин # 3 2-5 минут IX. Вода мытья (несколько изменений) пока вода не станет чистой X. Скотт воды (до синего ядер) 3 и более минут XI. Вода мытья (несколько изменений) 1-2 минуты XII. Eosin Y 1 минута XIII. Вода мытья (несколько изменений) 30 секунд XIV. 80% алкоголя 1 минута XV. 95% алкоголя 2 минуты XVI. 95% алкоголя 2 минуты XVII в. 100% спирта 3 минуты XVIII в. 100% спирта (чистый) 3 минуты XIX в. Ксилол 2 минут или больше XX в. Ксилол 2 минут или больше - Горы покровное на каждом слайде с Permount.
VI. Представитель Результаты
Рисунок 1. Покрытие облученного CF1 мышиных эмбриональных фибробластов в качестве фидерного слоя для культивирования ЭСК недифференцированные. MEFs высевают на ~ 50% слияния, как показано здесь, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре и в 6-и культуре блюдо. Бар, 100 мкм.
Рисунок 2. Пример subconfluent культуре недифференцированных ЭСК на слой фидерные MEF. ЭСК выращиваются на MEF фидерные слои до ~ 70% сливной, как показано здесь, то пассировать, как описано. Бар, 100 мкм.
Рисунок 3. Пример эксплантированных тератомы. После эксплантации, тератома, почек, и любой аксессуар ткани фиксируются как блок в формалине, затем почки и аксессуаров ткани, тщательно отделаны прочь перед вложением в парафин.
Рисунок 4. Тератомы производных из недифференцированных ЭСК содержат тканей представителем всех трех зародышевых листков в естественных условиях. Тератома, например, один изображен на рисунке 3, была разделена и окрашивали гематоксилином и эозином для идентификации эмбриональных тканей. ЭСК приводит к тканям производных от всех трех эмбриональных зародышевых листков (эктодермы (А, В), мезодермы (С), энтодермы (D). (А) находятся в стадии становления нейронные структуры трубки. (B) Примитивные плоского эпителия. (C) хряща окруженный капсулой уплотненной мезенхимы. (D) Железистая кишечной структуры. Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора.
Рисунок 5. Тератома анализ может быть использован для отображения судьбу меченых, недифференцированные ЭСК. Как ранее опубликованных (9), смесь специальные коды для ЭСК с немаркированные ЭСК может быть использована для перевода судьбу меченых клеток в анализе образование тератомы. Как показано здесь, недифференцированные ЭСК выражения поверхности маркер, CD133, и помечены с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP), были смешаны с немаркированные, недифференцированные ЭСК. Они были использованы для формирования тератомы путем почечной капсулы прививки. Иммуногистохимический анализ гематоксилином и эозином-окрашенные срезы тератома с анти-EGFP антител свидетельствует судьба нейроэктодермальная из ЭСК CD133 +. Тератомы были обработаны как показано на рисунке 4 и контрастно с анти-EGFP антител (коричневый) для локализации производные CD133 + GFP + клеток в тканях. CD133 +-клеток, полученных из (стрелки) были обнаружены в тканях, возникающие из эмбриональных эктодермы, в частности, нейронных эпителия (слева) и зарождающиеся нервной трубки-подобные структуры (справа). Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора.
Желатин
- 0,1% свиной желатин
- 99,9% DPBS
- Добавить желатин в DPBS, инкубировать при 37 ° С в течение одного часа или пока все желатин переходит в раствор, и фильтр стерилизуют (0.22μm) перед использованием.
MEF среда
- 10% эмбриональной телячьей сыворотки (квалифицированные)
- 90% Дульбеко изменения основных среднего (D-MEM)
- 1x L-глютамин
- 1x Pen / Strep
- Фильтры стерилизовать перед использованием.
KSR (Knockout сыворотки Замена) среде
- 20% Замена KnockOut сыворотки
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-глютамин
- 1x заменимые аминокислоты
- 0,1 мМ β-меркаптоэтанол /
- 12,5 нг / мл bFGF
- Фильтры стерилизовать.
- Хранить при температуре 4 ° С, но тепло до 37 ° C перед добавлением к клеткам.
- Добавить bFGF непосредственно перед употреблением.
Коллагеназы IV
- Растворите 1 мг / мл в среде KSR, поставив при температуре 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор.
- Фильтры стерилизовать.
Avertin
- 0,25 г 2,2,2-tribromoethanol
- 0,25 мл 2-метил-2-бутанол
- Инкубировать при 37 ° С в течение ночи в форме 100%-ный раствор.
- За несколько часов до операции, развести до 2,5% рабочего раствора использованием DPBS и инкубировать при температуре 37 ° С в течение не менее 1 часа.
- Фильтры стерилизовать и аликвоту.
- Tribromoethanol очень светочувствительные, так что защищать от света, на всех этапах подготовки и использования.
- Подготовка не более 12-24 часов перед использованием.
Бупренорфин
- 1 мг / мл маточного раствора в метаноле
- Развести до 0,015 мг / мл рабочего раствора использованием стерильных H 2 O.
- Хранить при -20 ° С до 1 месяца.
Кетопрофен
- 0,5 мг / мл рабочего раствора в DPBS
- Добавить DPBS, инкубировать в течение ночи при 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор.
- Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.
Discussion
Мы адаптировали высокоэффективного анализа тератома образованию с целью отображения судьба дифференциации в ЭСК в естественных условиях окружающей среды. Небольшое число специально отобранных ЭСК смешивается с недифференцированные ЭСК дикий тип и Phaseolus лектина обыкновенная сформировать осадок клеток. Это привитых под почечную капсулу в иммунодефицитных мышей. Судьба первоначально выбранного ЭСК могут быть определены иммуногистохимии (Рисунок 5), как сообщалось ранее (9). Этот метод обеспечивает ценный инструмент для выявления и генерации тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Всеобъемлющее Грант Исследования, проведенные в Калифорнийском Институте регенеративной медицины (RC1-00104), Службы общественного здравоохранения Грант (HL085377) от NHLBI, и подарок от Поллин Фонда HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
