Summary
Diferenciación dirigida de células embrionarias humanas en específico ha generado mucho interés en la medicina regenerativa. Ofrecemos una concisa, paso a paso el protocolo para determinar la
Abstract
Células madre embrionarias humanas (hESCs) tienen una capacidad ilimitada para la auto-renovación, y la capacidad de diferenciarse en células derivadas de las tres capas germinales embrionarias (1). Diferenciación dirigida de hESCs en tipos celulares específicos ha generado mucho interés en el campo de la medicina regenerativa (por ejemplo, (2-5)), y los métodos para determinar la
Protocol
El protocolo escrito a continuación se basa en los parámetros publicados reportados por los autores, con algunas modificaciones. El protocolo se lleva a cabo con la aprobación de la UCSF Cuidado de Animales Institucional y Uso (IACUC) y de células madre de Supervisión de Investigación (SCRO) Comités.
I. Cultura de células madre embrionarias humanas (hESCs)
- HESCs crecer en la norma 6-y (3,5 cm de diámetro, pozos) placas.
- Por lo menos 12 horas antes de pases células de fibroblastos de embriones de ratón de semillas (MEF, obtenido a partir CF1 día E12.5 ratones tiempo-acoplado, irradiados en 1000 Ci) células alimentadoras en placas recubiertas con 1% de gelatina (6,7). MEFs debe ser plateado en la confluencia 50-60%, o 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diámetro (véase figura 1).
- Las células de paso cuando las colonias han llegado a la confluencia ~ 70% (Figura 2).
- Al paso de las células, se aspira KSR medio de crecimiento (6) de los pozos y reemplazar con el medio de 0,5 ml que contiene colagenasa IV en KSR a una concentración de 1 mg / ml.
- Incubar las placas con colagenasa IV a 37 ° C / 5% CO 2 durante 5 minutos o hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la placa.
- Quitar colagenasa IV de la placa, añadir 0,5 ml de KSR a cada pocillo, y raspar las células de forma manual para eliminar por completo de la placa.
- Recoger la suspensión de células de cada lugar, así, en un tubo cónico de 15 ml, y permiten que las células de resolver por la gravedad durante 5 minutos.
- Eliminar el sobrenadante del tubo, dejando a las células y medianas empresas en un volumen total de ~ 300μl.
- El uso de un 200 l micro-pipeta conjunto a todo volumen, suavidad pipeta de la suspensión de células 5-6 veces para romper las colonias.
- Traiga la suspensión celular a un volumen total de 9 ml por pozo original de las células utilizando un medio de KSR (es decir, si un bien se cosecha, el tubo debe contener 9 ml). Complementar el medio con recombinante humano factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) a una concentración de 12,5 ng / ml.
- Después de lavar los nuevos pozos que contienen células MEF (ver paso 2) con fosfato de Dulbecco buffer salino (DPBS) para eliminar todo el suero, añadir 3 ml de la suspensión celular a cada pocillo e incubar las placas a 37 ° C / 5% CO 2.
- Cambio de medio KSR con bFGF 24 horas después de su paso, y cada 24-48 horas hasta que las células están listas para pasarse otra vez.
II. Preparación de células madre de pellets para injertar
- A las 24 horas antes del injerto, agregar inhibidor de rock en el medio de KSR a una concentración final de 10μM para aumentar la viabilidad celular (8). Un pocillo de células en la confluencia ~ 70% (5 x 10 5 células) creará dos pastillas, con dos bolitas que se adhieren por cápsula renal.
- Para preparar gránulos de las células para el injerto (9), se incuba la ROCA tratados con inhibidores de la colagenasa IV culturas durante 5 minutos a 37 ° C / 5% CO 2.
- Aspirar la colagenasa IV del pozo y reemplazarlo con un DPBS ml con 10% de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina).
- Raspar manualmente las colonias de la placa, enjuague el bien con un adicional de 1 ml DPBS con penicilina / estreptomicina, y la transferencia de cada alícuota de 1 ml de suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Girar los tubos de microcentrífuga brevemente a 8.000 x g, aspirar el sobrenadante y se resuspenden las pastillas en DPBS 500μl con penicilina / estreptomicina.
- Para ayudar a unir las células en conjunto para el trasplante, añadir 100μl de 1 mg / ml de lectina Phaseolus vulgaris (PHA) en DPBS a cada tubo.
- Se incuban las células / suspensión PHA a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego girar durante 2 minutos a 8000 x g. Gire los tubos de 180 º dentro de sus pozos de rotor y girar de nuevo durante 2 minutos a 8000 x g.
- Con cuidado, aspirar el sobrenadante dejando el sedimento intacto.
- Desalojar a los gránulos de las células de los tubos pipeteando suavemente KSR 200μl junto al borde de la pastilla hasta que lentamente se levanta.
- Una vez desalojados, transferir inmediatamente los pellets de 0.4μm inserta Millicell colocados en los pozos de 3,5 cm de diámetro que contiene 3 ml KSR, y se incuba durante 2 horas a la noche a 37 ° C / 5% CO 2.
III. Cápsula renal injerto
- Realizar todos los procedimientos con animales, de acuerdo con las directrices institucionales utilizando una técnica aséptica apropiada.
- Anestesiar a los ratones SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / Crl), con edades entre 8-12 semanas, utilizando una combinación de O2 inhalado 3% isoflurane/0.5% y tribromoetanol intraperitoneal (Avertin, 25 mg / kg recién preparada). Dos gránulos de las células por ratón será implantada utilizando las técnicas descritas (10).
- Después de colocar el ratón sobre una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia, afeitar el área de la incisión, y luego desinfectar con clorhexidina. Haga una incisión de 2,5 cm a través de la piel junto al centro, pero en paralelo a la columna vertebral.
- Mantener la humedad del área de la incisión con agua estéril saline, hacer una pequeña incisión a través del músculo, justo debajo de las costillas y ~ 1 cm de la columna vertebral. La incisión debe ser lo suficientemente grande como para sacar el riñón a través de, pero lo suficientemente pequeño que el riñón no se deslice hacia la cavidad abdominal sin fuerza.
- Tire suavemente el riñón a través de la incisión de los músculos con una pipeta Pasteur de vidrio que ha sido puesto en la forma de un gancho romo, ligeramente curvada.
- Mojar el riñón con DPBS estéril para evitar la cápsula se seque. Esto puede ser necesario repetir todo el procedimiento, como la cápsula es muy frágil.
- Utilizando unas pinzas Dumont n º 5, tire suavemente de la cápsula desde el riñón y hacer una incisión de 2 mm con unas tijeras Vannas primavera.
- Con otra pipeta de vidrio que ha sido puesto en una muy fina, la sonda roma, hacer un pequeño hueco entre la cápsula y el riñón.
- Usando una pipeta de gran orificio colocado en una pipeta de transferencia disponibles, tomar una sola célula de pellets a partir de la inserción Millicell. Asegúrese de tomar tan poco los medios de comunicación adicional a lo largo como sea posible, ya que el exceso de material puede interferir con la transferencia de pellets.
- Mientras se mantiene hasta el borde de la incisión para crear el bolsillo, coloque suavemente el pellet al lado de la apertura y empuje en el bolsillo hacia un polo del riñón con la pipeta tiró.
- Repita el proceso con una segunda pastilla. Lugar esta bajo la cápsula del riñón mismo, pero hacia el polo opuesto.
- Con cuidado, coloque la cápsula de vuelta a las pastillas. Los gránulos deben permanecer dentro de la bolsa, y no las suturas son necesarias para cerrar la cápsula.
- Empuje suavemente el riñón en la cavidad abdominal y cierre de la pared muscular con suturas de seda 4-0 (o menor) con adjuntos inversa corte aguja. La incisión debe ser lo suficientemente pequeño que sólo una única sutura es necesario.
- Cerca de la piel con una serie de 4-5 puntos sueltos, utilizando el mismo material de sutura.
- Antes de colocar el ratón de nuevo en su jaula, administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (11,12) y 5 mg / kg de ketoprofeno (12,13) como analgésico a corto plazo y largo plazo, respectivamente. Sustancias controladas sólo se utiliza de acuerdo con las directrices institucionales.
- La transferencia de los animales de vuelta a su jaula y se permite que se recupere de la anestesia en una manta eléctrica. Esto debe tomar alrededor de 20-30 minutos.
- Una vez que el ratón es totalmente ambulatoria, que pueden ser devueltos a las instalaciones de alojamiento de los animales.
IV. Cosecha teratoma, la fijación y seccionamiento
- En 8-12 semanas después de la cirugía, debe haber un teratoma apenas palpable cerca del riñón. Grandes, quistes llenos de líquido a menudo se desarrollan, así, a partir de las 6-8 semanas. Estos pueden requerir una cosecha más temprana si causan trastornos a los animales. Desde teratomas creciendo a un ritmo más lento que los quistes, sin embargo, tendrá que esperar el mayor tiempo posible para obtener un teratoma de tamaño suficiente para el análisis (es decir, por lo menos 8 semanas).
- Extirpar el riñón, el teratoma, y cualquier quiste rodea como un bloque de tejido de la cavidad abdominal utilizando el mismo método quirúrgico mediante el cual se accede al riñón original (véase la sección III, los pasos 1-4 arriba).
- Coloque el bloque de tejido extraído en un tubo que contiene 10% de formol.
- Deje que el teratoma para arreglar la noche a 4 ° C.
- Al día siguiente, retire el teratoma del tubo. Diseccionar los quistes y los riñones tanto como sea posible sin dañar el teratoma en sí mismo (Figura 3). Mayor teratomas pueden ser cortados por la mitad para facilitar la disección y la inclusión.
- Proceso del teratoma utilizando un estándar de parafina fijación técnica. Unidades automatizadas están disponibles (por ejemplo, hipercentro Shandon):
I. 80% de Flex alcohol 2 horas II. 80% de Flex alcohol 1 hora III. 85% de Flex alcohol 1,5 horas IV. 95% de Flex alcohol 1 hora V. Flex 100% alcohol 1 hora VI. Flex 100% alcohol 1 hora VII. Flex 100% alcohol 1 hora VIII. Claro-Rite 3 1 hora IX. Claro-Rite 3 1 hora X. Claro-Rite 3 1 hora XI. Parafina (TissuePrep) 2 horas XII. Parafina (TissuePrep) 2 horas
V. La inmunohistoquímica y análisis
- Una vez incluidos en parafina, la sección de teratoma en 5μm cortes seriados con un micrótomo rotatorio, y las secciones de flotar en las diapositivas.
- Antes de la tinción, los portaobjetos para cocer al menos una hora.
- Tinción de las láminas con hematoxilina y eosina con los métodos estándar para identificar las estructuras de tejido representante de cada una de las tres capas germinales embrionarias (Figura 4):
I. Lavado de xileno 3-5 minutos II. Xileno 3-5 minutos III. 100% de alcohol 3-5 minutos IV. 100% de alcohol 3-5 minutos V. 95% de alcohol 3-5 minutos VI. 80% de alcohol 3-5 minutos VII. Agua de lavado (varios cambios) 2 minutos VIII. Hematoxilina de Gill # 3 2-5 minutos IX. Agua de lavado (varios cambios) hasta que el agua salga clara X. Agua de Scott (a los núcleos azules) 3 minutos o más XI. Agua de lavado (varios cambios) 1-2 minutos XII. Eosina 1 minuto XIII. Agua de lavado (varios cambios) 30 segundos XIV. 80% de alcohol 1 minuto XV. 95% de alcohol 2 minutos XVI. 95% de alcohol 2 minutos XVII. 100% de alcohol 3 minutos XVIII. 100% de alcohol (limpia) 3 minutos XIX. Xileno 2 minutos o más XX. Xileno 2 minutos o más - Montar un cubreobjetos sobre cada diapositiva con Permount.
VI. Resultados representante
Figura 1. Revestimiento de elementos combustibles irradiados CF1 fibroblastos embrionarios de ratón como una capa de conexión para el cultivo de hESCs indiferenciada. MEFs se colocan en la confluencia de ~ 50%, como se muestra aquí, o 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diámetro y en una placa de cultivo de 6 pocillos. Bar, 100 micras.
Figura 2. HESCs ejemplo de la cultura subconfluentes de hESCs indiferenciadas en una capa de alimentación MEF. Se cultivan en las capas de alimentación MEF hasta ~ 70% de confluencia, como se muestra aquí, como se describe pasajes. Bar, 100 micras.
Figura 3. Ejemplo de teratomas explantados. Después de la explantación, el teratoma, el riñón y los tejidos accesorio se fija como un bloque en formol, el riñón y el tejido de accesorios son cuidadosamente recortada antes de inclusión en parafina.
Figura 4. Los teratomas derivados de hESCs indiferenciada contienen representante de los tejidos de todas las tres capas germinales en vivo. Un teratoma, como una muestra en la Figura 3, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina para identificar los tejidos embrionarios. hESCs dar lugar a tejidos derivados de las tres capas germinales embrionarias (ectodermo (A, B), el mesodermo (C), endodermo (D). (A) la estructura naciente del tubo neural. (B) epitelio escamoso primitivo. (C) El cartílago rodeado por una cápsula de mesénquima condensado. (D) la estructura glandular intestinal. Bar, 100 micras. Imágenes reimpreso con el permiso del autor.
Figura 5. Análisis de teratoma puede ser utilizado para trazar el destino de los etiquetados, hESCs indiferenciada. Como ya se ha publicado (9), una mezcla de hESCs específicamente etiquetados con hESCs sin etiqueta se puede utilizar para trazar el destino de las células marcadas en un ensayo de formación de teratoma. Como se muestra aquí, hESCs indiferenciadas que expresan el marcador de superficie, CD133, y etiquetada con el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP), se mezclaron con hESCs sin etiquetar, indiferenciado. Estos fueron utilizados para formar teratomas por la cápsula renal del injerto. El análisis inmunohistoquímico de hematoxilina y eosina secciones teñidas con teratoma con anti-eGFP anticuerpos demuestra el destino neuroectodérmico de la CD133 + hESCs. Los teratomas fueron procesados como en la Figura 4 y contrastados con anticuerpos anti-eGFP (marrón) para localizar los derivados de células CD133 + GFP + dentro de los tejidos. CD133 + derivadas de las células (flechas) se observaron en los tejidos derivados del ectodermo embrionario, el epitelio neural específica (izquierda) y de la naciente neural, como estructuras tubulares (derecha). Bar, 100 micras. Imágenes reimpreso con el permiso del autor.
Gelatina
- 0,1% de gelatina porcina
- DPBS 99,9%
- Agregue la gelatina a DPBS, se incuba a 37 ° C durante una hora o hasta que la gelatina se disuelve, y esterilizar filtro (0.22μm) antes de su uso.
MEF medio
- 10% de suero fetal bovino (calificados)
- 90% de Dulbecco modificado del medio esenciales (D-MEM)
- 1x L-Glutamina
- 1x penicilina / estreptomicina
- Filtro de esterilización antes de su uso.
KSR (sustitución de golpe de gracia en suero) medio
- 20% de sustitución de suero golpe de gracia
- 80% golpe de gracia D-MEM
- 1x L-Glutamina
- 1x aminoácidos no esenciales
- 0,1 mM β-mercaptoetanol /
- 12.5 ng / ml de bFGF
- Filtro de esterilización.
- Almacenar a 4 ° C, pero cálido a 37 ° C antes de añadir a las células.
- Añadir bFGF inmediatamente antes del uso.
Colagenasa IV
- Disolver 1 mg / ml en medio de KSR, colocando a 37 ° C durante 1-2 horas o hasta que todo el polvo se disuelve.
- Filtro de esterilización.
Avertin
- 0,25 g de 2,2,2-tribromoetanol
- 0,25 ml de 2-metil-2-butanol
- Se incuba a 37 ° C durante la noche para formar 100% de la solución.
- Varias horas antes de la cirugía, solución diluida al 2,5% de trabajo con DPBS y se incuba a 37 ° C durante al menos 1 hora.
- Filtro de esterilización y alícuota.
- Tribromoetanol es altamente sensible a la luz, por lo que protegerlo de la luz en todas las etapas de preparación y uso.
- Preparar no más de 12-24 horas antes de su uso.
La buprenorfina
- 1 mg / ml de solución stock en metanol
- Diluir a 0,015 mg / ml de solución estéril de trabajo utilizando H 2 O.
- Almacenar a -20 ° C hasta por 1 mes.
Ketoprofeno
- 0,5 mg / ml de solución de trabajo en DPBS
- Añadir DPBS, incubar durante la noche a 37 ° C durante 1-2 horas o hasta que todo el polvo se disuelve.
- Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
Discussion
Hemos adaptado un ensayo de formación de teratomas altamente eficiente para la elaboración de mapas de la suerte de diferenciar hESCs en un entorno en vivo. Un pequeño número de hESCs específicamente seleccionados se mezcla con indiferenciado hESCs de tipo salvaje y lectina de Phaseolus vulgaris para formar un pellet de células. Esto es injertado debajo de la cápsula renal en un ratón inmunodeficiente. El destino de la hESCs seleccionado originalmente, se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura 5), como se informó anteriormente (9). Este método proporciona una valiosa herramienta para la identificación y la generación de tejidos reactivos específicos para la terapia basada en células.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación integral en el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RC1-00104), un Servicio de Salud Pública Grant (HL085377) del NHLBI, y un regalo de la Fundación Pollin de HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
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