Summary
Riktad differentiering av hESCs till specifika celler har genererat mycket intresse för regenerativ medicin. Vi ger en kortfattad och steg-för-steg-protokollet för att fastställa
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har en obegränsad förmåga till förnyelse, och förmåga att differentiera till celler som härrör från alla tre embryonala groddblad (1). Riktad differentiering av hESCs till specifika celltyper har genererat mycket intresse inom området för regenerativ medicin (t.ex. (2-5)), och metoder för att bestämma
Protocol
Den skriftliga protokoll nedan baseras på publicerad parametrar som rapporterats av författarna, med vissa ändringar. Protokollet sker med godkännande från UCSF Institutional Animal Care och användning (IACUC) och stamcellsforskning tillsyn (Bolagsverket) kommittéer.
I. Kultur för mänskliga embryonala stamceller (hESCs)
- Väx hESCs i standard 6-bra (3,5 cm i diameter brunnar) plattor.
- Minst 12 timmar före passaging celler, utsäde möss embryonala fibroblaster (MEF, från CF1 dag e12.5 tidsinställda-parade möss, bestrålade på 1000 Ci) feeder celler på tallrikar täckta med 1% gelatin (6,7). MEFs bör vara klädd på 50-60% sammanflödet, eller 4 x 10 5 celler per 3,5 cm diameter bra (figur 1).
- Passage celler kolonier nått ~ 70% sammanflödet (figur 2).
- För att passagen cellerna, aspirera KSR odlingsmedium (6) från brunnarna och ersätt med 0,5 ml medium som innehåller kollagenas IV i KSR vid en koncentration av 1 mg / ml.
- Inkubera plattorna med kollagenas IV vid 37 ° C / 5% CO 2 i 5 minuter eller tills kanterna av kolonier börjar lyfta från plattan.
- Ta bort kollagenas IV från plattan, tillsätt 0,5 ml av KSR i varje brunn, och manuellt skrapa celler att helt ta bort från plattan.
- Samla cellsuspensionen från varje brunn, plats i en 15 ml konisk tub, och låta cellerna att reglera genom gravitationen i 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten från röret, lämnar celler och medium i en total volym på ~ 300μl.
- Med hjälp av en 200 l mikro-pipett inställd på full volym, försiktigt pipett cellsuspensionen 5-6 gånger för att bryta upp kolonier.
- Ta cellsuspensionen till en total volym på 9 ml per ursprunglig väl av celler med hjälp av KSR medium (dvs om en väl skördas bör röret innehåller 9 ml). Komplettera medium med rekombinant humant grundläggande fibroblast growth factor (bFGF) till en koncentration på 12,5 ng / ml.
- Efter tvättning av nya brunnar innehåller MEF celler (se steg 2) med Dulbecco är fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) att ta bort alla serum, tillsätt 3 ml av cellsuspensionen till varje brunn och inkubera plattorna vid 37 ° C / 5% CO 2.
- Ändra KSR medium med bFGF 24 timmar efter passagen, och varje 24-48 timmar tills cellerna är redo att passerats igen.
II. Beredning av hESC pellets för ympning
- Efter 24 timmar före kirurgi, lägga ROCK-hämmare till KSR medellång till en slutlig koncentration av 10μM att öka cellviabiliteten (8). Ett väl av celler vid ~ 70% sammanflödet (5 x 10 5 celler) kommer att skapa två pellets, med två pellets isatt per njure kapsel.
- För att förbereda cell pellets för ympning (9), inkubera Rock hämmaren-behandlade kulturer med kollagenas IV i 5 minuter vid 37 ° C / 5% CO 2.
- Aspirera kollagenas IV från brunnen och ersätt med 1 ml DPBS med 10% penicillin / streptomycin (penna / STREP).
- Manuellt skrapa kolonierna från plattan, skölj väl med ytterligare 1 ml DPBS med penna / streptokocker, och överför varje 1ml alikvot av cellsuspension till 1,5 ml mikrofugrör.
- Spin mikrofugrör rör kort på 8000 x g, aspirera supernatanten och suspendera pellets i 500μl DPBS med penna / streptokocker.
- För att hjälpa binda celler tillsammans för transplantation, lägg 100μl 1 mg / ml Phaseolus vulgaris lektin (PHA) i DPBS till varje rör.
- Inkubera cellen / PHA fjädring i rumstemperatur i 5 minuter och sedan snurra i 2 minuter vid 8000 x g.. Rotera rören 180 ° inom sina rotor brunnar och snurra igen i 2 minuter vid 8000 x g..
- Försiktigt aspirera supernatanten lämnar pellets intakt.
- Rubba cellen pellets från rören genom att försiktigt pipettera 200μl KSR intill kanten av pellets tills det sakta lyfter upp.
- När lossnat, omgående överlåta pellets till 0.4μm MILLICELL bilagor placeras i 3,5 brunnar cm diameter innehåller 3 ml KSR, och inkubera i 2 timmar eller över natten vid 37 ° C / 5% CO 2.
III. Nedsatt kapsel ympning
- Utför alla animaliska förfaranden i enlighet med institutionens riktlinjer med lämplig aseptisk teknik.
- Bedöva SCID beige möss (CB17.Cg-Prkdc Scid Lyst BG / CRL), i åldern 8-12 veckor, med en kombination av inhalerade 3% isoflurane/0.5% O2 och intraperitoneal tribromoethanol (Avertin, 25 mg / kg nyberedd). Två cell pellets per mus kommer att engrafted hjälp beskrivas tekniker (10).
- Efter att placera musen på en värmedyna för att förebygga hypotermi, raka snitt området, därefter desinfektera den med klorhexidin. Gör en 2,5 cm snitt genom huden strax utanför centrum, men parallellt med ryggraden.
- Håll fuktigt snittet området med sterilt Saline, göra ett mindre snitt genom muskeln, precis under revbenen och ~ 1 cm från ryggraden. Snittet ska vara precis tillräckligt stor för att dra i njurarna igenom, men tillräckligt små för att njuren inte glider tillbaka in i bukhålan utan kraft.
- Dra njure försiktigt genom muskeln snittet med hjälp av ett glas pasteurpipett som dragits in i forma av en trubbig, lätt böjd krok.
- Blöt njurarna med steril DPBS att hindra kapseln från att torka ut. Detta kan vara nödvändigt att upprepa hela förfarandet, eftersom kapseln är mycket bräcklig.
- Använda Dumont # 5 pincett, dra försiktigt kapseln upp från njuren och gör en 2 mm snitt med Vannas våren sax.
- Med en annan glaspipett som har dragits in i en mycket fin, slö sond, göra en liten ficka mellan kapsel och njurarna.
- Med hjälp av en stor öppning pipettspetsen placeras på en disponibel överföringspipett, ta en enda cell pellets från MILLICELL insatsen. Se till att ta så lite extra media tillsammans som möjligt, eftersom överskott media kan störa pelleten överföringen.
- Håll upp kanten av snittet för att skapa ficka, försiktigt placera pellets intill öppningen och tryck in den i fickan mot en stolpe i njuren med drog pipetten.
- Upprepa processen med en andra pellets. Placera detta under kapsel av samma njure, men mot den motsatta polen.
- Placera försiktigt kapseln tillbaka ner på pellets. Pellets bör stanna inom fickan, och inga suturer är nödvändiga för att stänga kapsel.
- Tryck försiktigt njurarna tillbaka in i bukhålan och stänga muskeln väggen med 4-0 silke suturer (eller mindre) med tillhörande omvänd skärande nål. Snittet bör vara tillräckligt liten att endast en enda sutur är nödvändig.
- Nära huden med en serie av 4-5 avbryts sömmar, med samma suturmaterial.
- Innan du placerar musen tillbaka i sin bur, administrera 0,05 mg / kg buprenorfin (11,12) och 5 mg / kg ketoprofen (12,13) som kort och lång sikt analgetika, respektive. Kontrollerade ämnen får endast användas i enlighet med institutionella riktlinjer.
- Överför djuret tillbaka till sin bur och gör det möjligt att återhämta sig från narkos på en värmedyna. Detta bör ta ca 20-30 minuter.
- När musen är helt rörlig, kan den returneras till djurstallar anläggningen.
IV. Teratom skörd, fixering och sektionering
- Vid 8-12 veckor efter operation bör det finnas en knappt påtaglig teratoma nära njurarna. Stor, vätskefyllda cystor ofta utvecklas också, med början på 6-8 veckor. Dessa kan kräva en tidigare skörd om de orsakar lidande för djuret. Sedan teratom växa långsammare än cystor, men vill du vänta så länge som möjligt för att få en teratoma av tillräcklig storlek för analys (dvs minst 8 veckor).
- Ta bort njuren, teratoma och alla omgivande cystor som ett block av vävnad från bukhålan med samma kirurgiska tillvägagångssätt som njurarna var ursprungligen visats (se avsnitt III, steg 1-4 ovan).
- Placera hela block av exciderad vävnad in i ett rör som innehåller 10% buffrad formalin.
- Låt teratoma att fixa över natten vid 4 ° C.
- Följande dag, ta bort teratoma från röret. Dissekera bort alla cystor och så mycket njure som möjligt utan att skada teratoma själv (Figur 3). Större teratom kan halveras för att underlätta dissekering och inbäddning.
- Behandla teratoma med en vanlig paraffin-fixering teknik. Automatiserade enheter är tillgängliga (t.ex., Shandon Hypercenter):
I. 80% Flex alkohol 2 timmar II. 80% Flex alkohol 1 timme III. 85% Flex alkohol 1,5 timmar IV. 95% Flex alkohol 1 timme V. 100% Flex alkohol 1 timme VI. 100% Flex alkohol 1 timme VII. 100% Flex alkohol 1 timme VIII. Clear-Rite 3 1 timme IX. Clear-Rite 3 1 timme X. Clear-Rite 3 1 timme XI. Paraffin (TissuePrep) 2 timmar XII. Paraffin (TissuePrep) 2 timmar
V. Immunohistokemi och analys
- När inbäddade i paraffin, avsnitt teratoma i 5μm serie skivor med hjälp av en roterande mikrotom och avsnitt flyta på diabilder.
- Före färgning, baka bilderna i minst en timme.
- Färga glasen med hematoxylin och eosin med vanliga metoder för att identifiera vävnaden strukturer representant för envar av de tre embryonala groddblad (Figur 4):
I. Xylen tvätta 3-5 minuter II. Xylen 3-5 minuter III. 100% alkohol 3-5 minuter IV. 100% alkohol 3-5 minuter V. 95% alkohol 3-5 minuter VI. 80% alkohol 3-5 minuter VII. Vattenskrubber (flera förändringar) 2 minuter VIII. Gills Hematoxylin # 3 2-5 minuter IX. Vattenskrubber (flera förändringar) tills vattnet är klart X. Scotts vatten (till blå kärnor) 3 minuter eller mer XI. Vattenskrubber (flera förändringar) 1-2 minuter XII. Eosin Y 1 minut XIII. Vattenskrubber (flera förändringar) 30 sekunder XIV. 80% alkohol 1 minut XV. 95% alkohol 2 minuter XVI. 95% alkohol 2 minuter XVII. 100% alkohol 3 minuter XVIII. 100% alkohol (ren) 3 minuter XIX. Xylen 2 minuter eller mer XX. Xylen 2 minuter eller mer - Montera ett täckglas på varje bild med Permount.
VI. Representativa resultat
Figur 1. Plätering av bestrålat CF1 musen embryonala fibroblaster som en feeder lager för odling odifferentierade hESCs. Är pläterade på ~ 50% sammanflödet MEFs, som visas här, eller 4 x 10 5 celler per 3,5 cm diameter bra i ett 6-bra kultur skålen. Bar, 100 ìm.
Figur 2. Exempel på subconfluent kultur odifferentierad hESCs på en MEF matare lager. HESCs odlas på MEF matare lager tills ~ 70% konfluenta, som visas här, sedan passerats som beskrivs. Bar, 100 ìm.
Figur 3. Exempel på explanterade teratom. Efter borttagning, är teratoma, njure, och alla tillbehör vävnad fast som ett block i formalin, då njurarna och tillbehör vävnad är noggrant putsas bort innan inbäddning i paraffin.
Figur 4. Teratom från odifferentierade hESCs innehåller vävnader representativa för alla tre groddblad in vivo. En teratoma, såsom en visas i Figur 3, var sektioneras och färgades med hematoxylin och eosin att identifiera embryonala vävnader. hESCs ge upphov till vävnader från alla tre embryonala groddblad (ektoderm (A, B), mesoderm (C), endoderm (D). (A) begynnande neuralrörsdefekter struktur. (B) Primitiva skivepitelcancer epitel. (C) Brosk omgiven av kapsel av kondenserad mesenkym. (D) Glandulär intestinal struktur. Bar, 100 ìm. Bilder återges med tillstånd av författaren.
Figur 5. Teratom analys kan användas för att kartlägga öde taggade, odifferentierade hESCs. Som tidigare publicerats (9), en blandning av speciellt taggade hESCs med otaggade hESCs kan användas för att kartlägga vad som händer med de märkta celler i en teratom formation analys. Som visas här, var odifferentierade hESCs uttrycka ytan markör, CD133, och märkta med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), blandat med otaggade, odifferentierade hESCs. Dessa användes för att bilda teratom genom renal kapsel ympning. Immunhistokemiska analyser av hematoxylin och eosin-färgade snitt teratoma med anti-EGFP antikropp visar neuroektodermal öde CD133 + hESCs. Teratom behandlades som i Figur 4 och counterstained med anti-EGFP antikropp (brun) för att lokalisera derivat av CD133 + GFP + celler i vävnader. CD133 +-härledda celler (pilar) observerades i vävnader som härrör från embryonala ektoderm, speciellt neurala epitelet (vänster) och begynnande neuralrörsdefekter-liknande strukturer (höger). Bar, 100 ìm. Bilder återges med tillstånd av författaren.
Gelatin
- 0,1% Svin gelatin
- 99,9% DPBS
- Lägg gelatinet i DPBS, inkubera vid 37 ° C i en timme eller tills alla gelatin går i lösning och filtrera sterilisera (0.22μm) före användning.
MEF medelstora
- 10% fetalt bovint serum (Kvalificerad)
- 90% Dulbecco ändrade Essential Medium (D-MEM)
- 1x L-glutamin
- 1x Penna / Strep
- Filtrera sterilisera före användning.
KSR (Knockout Serum Replacement) Medium
- 20% Knockout Serum Replacement
- 80% Knockout D-MEM
- 1x L-glutamin
- 1x onödiga Aminosyror
- 0,1 mM β-merkaptoetanol /
- 12,5 ng / ml bFGF
- Filter sterilisera.
- Förvaras vid 4 ° C, men varmt till 37 ° C innan du lägger till celler.
- Lägg bFGF omedelbart före användning.
Kollagenas IV
- Lös upp 1 mg / ml i KSR medium genom att placera vid 37 ° C i 1-2 timmar eller tills allt pulver går i lösning.
- Filter sterilisera.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-tribromoethanol
- 0,25 ml 2-metyl-2-butanol
- Inkubera vid 37 ° C över natten för att bilda 100% lösning.
- Flera timmar före kirurgi, späd till 2,5% brukslösning med DPBS och inkubera vid 37 ° C i minst 1 timme.
- Filtrera sterilisera och delmängd.
- Tribromoethanol är mycket ljuskänslig, så skydda den mot ljus i alla stadier av beredning och användning.
- Förbered inte mer än 12-24 timmar före användning.
Buprenorfin
- 1 mg / ml stamlösning i metanol
- Späd till 0,015 mg / ml brukslösning med steril H 2 O.
- Lagra vid -20 ° C upp till 1 månad.
Ketoprofen
- 0,5 mg / ml brukslösning i DPBS
- Lägg DPBS, inkubera över natten vid 37 ° C i 1-2 timmar eller tills allt pulver går i lösning.
- Filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C.
Discussion
Vi har anpassat en högeffektiv analys teratom bildas i syfte att kartlägga öde differentiera hESCs i en in vivo-miljö. Ett litet antal speciellt utvalda hESCs blandas med odifferentierad vildtyp hESCs och Phaseolus vulgaris lektin att bilda en cellpellet. Detta är ympade under njurarna kapsel på ett nedsatt immunförsvar mus. Ödet för de ursprungligen utvalda hESCs sedan kan bestämmas genom immunohistokemi (Figur 5), som tidigare rapporterats (9). Denna metod ger ett värdefullt verktyg för att identifiera och skapa vävnadsspecifika reagenser för cell-baserad terapi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en omfattande forskning Grant från California Institute för regenerativ medicin (RC1-00104), en Public Health Service Grant (HL085377) från NHLBI, och en gåva från Pollin Foundation för HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
