Summary
SELEX protocoles comprennent plusieurs tours de sélection, dont chacun nécessite la régénération des ligands, qui exigent à leur tour des séquences d'amorces flanquant les régions fixes bibliothèque aléatoire. Ces séquences d'amorces fixes peuvent interférer avec le processus de sélection (faux positifs et négatifs). Nous présentons ici un apprêt sans protocole.
Abstract
Les aptamères sont des oligonucléotides hautement structurés (ADN ou ARN) qui peuvent se lier à des cibles avec des affinités comparables aux anticorps 1. Ils sont identifiés par un processus de sélection in vitro appelée évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) pour reconnaître une grande variété de cibles, à partir de petites molécules à des protéines et autres macromolécules 2-4. Les aptamères ont des propriétés qui sont bien adaptés pour in vivo de diagnostic et / ou des applications thérapeutiques: Outre une bonne spécificité et d'affinité, ils sont facilement synthétisés, survivre à des conditions de traitement plus rigoureux, ils sont peu immunogènes, et leur taille relativement petite peut entraîner la pénétration facile des tissus.
Les aptamères qui sont identifiés par le processus SELEX standards comprennent généralement ~ 80 nucléotides (nt), car ils sont généralement choisis dans les bibliothèques d'acides nucléiques avec ~ 40 nt à long régions randomisée en plus des sites d'amorce fixe de ~ 20 nt de chaque côté. Les séquences des amorces fixes ne peuvent donc représentent près de ~ 50% des séquences de bibliothèque, et peuvent donc positivement ou négativement compromis identification des aptamères dans le processus de sélection des trois, bien que les approches de bioinformatique suggèrent que les séquences fixes ne contribuent pas de manière significative à la structure après la sélection aptamère 5 . Pour répondre à ces problèmes potentiels, des séquences d'amorces ont été bloqués par des oligonucléotides complémentaires ou commuté à Midway différentes séquences au cours des tours de SELEX 6, ou ils ont été taillés à 6-9 NT 7, 8. Wen et Gray 9 conçu un apprêt sans méthode SELEX génomique, dans laquelle les séquences des amorces ont été complètement retirés de la bibliothèque avant la sélection et ont été ensuite régénéré pour permettre l'amplification de l'fragments génomiques sélectionnés. Cependant, d'employer la technique, d'une bibliothèque génomique unique doit être construit, qui possède la diversité limitée, et la régénération après cycles de sélection repose sur une étape réamplification linéaire. Sinon, les efforts visant à contourner les problèmes causés par des séquences d'amorces fixes en utilisant le partitionnement à haute efficacité sont remplies avec des problèmes concernant l'amplification par PCR 10.
Nous avons développé une méthode d'amorce sans sélection (PF) qui simplifie considérablement les procédures de SELEX et élimine efficacement les interférences problèmes amorce 11, 12. Les protocoles de travail d'une manière directe. La région centrale aléatoire de la bibliothèque est purifiée sans parasites séquences flanquantes et est lié à une cible appropriée (par exemple pour une protéine purifiée ou de mélanges complexes tels que les lignées cellulaires). Puis les séquences liées sont obtenues, réunis avec des séquences flanquantes, et re-amplifiés pour générer certains sous-bibliothèques. À titre d'exemple, voici, nous avons sélectionné des aptamères d'S100B, un marqueur protéique de mélanome. Essais de liaison ont montré Kd s dans les 10 -7 à 10 -8 M large après quelques tours de sélection, et nous démontrons que les aptamères fonctionner efficacement dans un format en sandwich contraignant.
Protocol
1. Brève description des protocoles sans apprêt sélection
Une banque d'ADN double brin a été construit en utilisant la PCR avec les oligonucléotides correspondant (Figure 1 et 2, l'étape a), qui contiennent un domaine central aléatoire de 30 nt, flanqué de deux régions d'apprêt. Deux protocoles légèrement différente "amorce-libres» (PF) ont été développés. Dans la bibliothèque ADNdb, la région 5'-contient une endonucléase "entailler" site pour l'endonucléase Nt.BstNBI; cette enzyme reconnaît dsDNA mais clive un seul brin du substrat d'ADN. La région 3 'de la bibliothèque ADNdb contient un autre "entailler" site, pour le Nt.BbvCI endonucléase qui reconnaît également dsDNA mais clive un seul brin, laissant un CC à l'extrémité 3 (PF 1), ainsi que d'un BspMI site de restriction par endonucléase, qui clive les deux brins ne laissant aucune supplémentaire de 3 'nucléotides (PF 2). Nous emploient généralement le PF 1 protocole initialement (parce que ses plus facile de fragments séparés produite pendant le processus de sélection; voir ci-dessous), puis emploient le PF 2 protocole pour les rondes subséquentes de sélection.
Le NT 32 de 5'-PN30-CC-3 'fragment (désigné 32 + fragment) et le NT 30 de 5'-PN30-3' fragment (désigné 30 + fragment) ont été respectivement généré par Nt.BbvCI / Nt . BstNBI ou BspMI / Nt.BstNBI clivage de la bibliothèque ADNdb, et le gel de purification. Les 32 +-fragment contient le domaine NT 30 aléatoires, avec une séquence flanquant CC à l'extrémité 3'-(PF 1). Les 30 +-fragment (PF 2) se compose uniquement des 30 séquences de domaine NT aléatoire. Le «soi-pont" 66 - fragment (contenant le hasard N30 région 5 'et 3' flanquantes) a été obtenu par purification sur gel (ou Nt.BbvCI Nt.BstNBI ne coupe que la partie supérieure "+" brin). Cette auto-pont est obtenu directement à la PF 1 du protocole, ou peuvent être générés et isolées après coupure de l'ADN des bibliothèques avec seulement NtBbv.CI ou Nt.BstNBI pour le PF 2 du protocole (figure 1 et 2, l'étape b). Les 32 + - ou + 32 fragments ont été incubées avec des protéines purifiées ou des cellules de mélanome en culture afin de permettre les fragments se lient à des protéines ou des cellules, puis les fragments non liés ont été emportés (figure 1 et 2, l'étape c). Les fragments reliés ou sélectionnés ont été utilisés pour re-génération des régions apprêt.
Dans la réaction d'hybridation / ligation, le pont a été auto-produit et purifié dans le même temps que les 32 + - et 30 +-fragment de purification; 5'-end amorce a été la même que la construction de bibliothèques et l'extrémité 3 'des amorces ont été remplacés avec appariement des amorces qui contenait également une Sp6 supplémentaires promoteur de la transcription à l'extrémité 3'-(Figure 1 et 2, l'étape d). Les produits de la réaction d'hybridation / ligation ont été ensuite utilisés pour la transcription in vitro de l'ARN (figure 1 et 2, l'étape e). Suite à la transcription de l'ARN, les ADN ligaturés (y compris le fragment d'ADN auto-pont non sélectionné) ont été digérés par la DNase I pour enlever les séquences de fond parasites. La transcription inverse (RT)-PCR de données ont montré que l'amorce régénérée produits ont été efficacement réamplifiés, constituant un «cycle» de la sélection (figure 1 et 2, l'étape f). L'amplification de fond montré au nombre de cycle élevé dans la PCR-RT de contrôle ne peut être complètement enlevée par une digestion supplémentaire DNase I, et n'est pas détectable après un nombre de cycle inférieur, ce qui nous emploient couramment.
Après 7 tours de sélection, des aptamères ont été caractérisés pour des propriétés de fixation. Kd étaient tous dans la gamme M 10 -7 10 -8 (figure 3). Dans les essais de liaison, différentes paires d'aptamères montré liant additif, ce qui indique qu'ils cibler des sites distincts sur la protéine S100B. Nous avons donc testé paires d'aptamères dans le «sandwich» des dosages de liaison, à la fois sur les puces de verre (lames Codelink) en utilisant marqués par fluorescence aptamères seconde, et sur des nanofils d'or dérivatisé avec aptamères seconde couplée à des nanoparticules d'or 50 nm (AuNPs; figure 3). Dans les deux cas, la spécificité de liaison a été élevé: sur les puces Codelink, aucune liaison sandwich a été observé avec les aptamères qui ne montrent pas d'additif obligatoire dans les déterminations Kd. Avec nanofils dérivés, nous avons observé pratiquement aucune liaison aux protéines non-cibles et complexes sandwich individuels peuvent être observés via le AuNPs aptamère couplées (Figure 3).
2. Matériaux
2.1. Génération de l'ADN Bibliothèque PF et réamplification de fragments Bound
Les détails sont décrits dans la poêle et Clawson, 2009; Pan et al, 2008..2.2. Purifié de sélection à base de protéines
- 20 mM Tris-HCl, pH 7,4
- 32 + et 30 + Fragment-fragment
- Tampon de sélection (2,5 mM CaCl2, MgCl2 5 mM dans le 1X tampon phosphate salin, pH 7,4, Gibco)
- Ni-NTA billes d'agarose (Qiagen)
- Colonne Polypropylène (Qiagen)
- Tampon de liaison (50 mM Na 2 HPO 4 2 PO 4, pH 7,2, NaCl 150 mM)
- Exprimé, protéine purifiée S100B dans le tampon de liaison (5 ug / uL)
- Phénol: CHCl3: IAA (pH 7,9, Ambion)
- NaAc 3 M, pH 5,2
- 100%, et 70% d'éthanol
2.3. TOPO clonage et l'analyse par séquençage de l'ADN double brin bibliothèques sélectionnées
- 7 ème ronde sélectionné des produits de PCR (tours supplémentaires peuvent être effectuées à poursuivre l'optimisation de aptamère de liaison)
- pCR2.1-TOPO Vecteur (Invitrogen)
- DH5 cellules qui le composent (Invitrogen)
- Plasmid Mini Kit (Qiagen)
- M13 amorce sens
- Informax Vector NTI (Invitrogen)
2.4. Caractéristiques de liaison du aptamères
- Oligos aptamères et de contrôle (N 30 et N 30 CC, IDT)
- T4 polynucléotide kinase (New England Biolabs)
- γ-32 P-ATP (3000 Ci / mmol; 10 pCi / ml)
- Purifié S100B dans le tampon de liaison (5 ug / uL)
2.5. Essais en sandwich avec des protéines de liaison S100B purifié et aptamères sélectionnés
- Le 1 er aptamère a été couplé à deux a.) Codelink diapositives biopuces ou b.) Au nanofils.
- Purifié S100B protéines, soit dilué à 0,125 uM dans 70 ul d'une) ou 1 uM dans 50 ul pour b).
- Le 2 ème aptamère a été soit étiqueté avec a.) AlexaFluor 546 pour les diapositives array Codelink, ou b.) couplé à 50 nm pour AuNPs les études avec des nanofils Au dérivés.
3. Méthodes
3.1. Génération de l'ADN Bibliothèque PF
Méthodes et protocoles détaillés pour la sélection des aptamères peuvent être trouvés dans la poêle et Clawson, 2009; Pan et al, 2008..
3.2. Sélection aptamères utilisant purifiée S100B protéines
Homme S100 de calcium binding protein B (S100B. Gene ID # 6285) a été utilisé comme une cible. Les protéines Son 6-S100B marqués (98 acides aminés de longueur) a été exprimée et purifiée en utilisant le système QIAexpressionist. (QIAGEN). Si vous le souhaitez ou indiquées, le son 6-tag peut être retiré par voie enzymatique. Pendant les cycles de sélection, 1 échantillon uL de chaque étape a été sauvé par scintillation liquide pour déterminer l'efficacité globale contraignant.
3.2.1. Préparation de la Bibliothèque PF-fragments d'ADN
- Re-suspendre les + 32 et 30 fragments + dans 40 ul de 20 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Faire chauffer 3 min à 85 ° C et refroidir à 37 ° C pendant 3 min dans un incubateur de 37 ° C.
- Ajouter uL 760 de tampon de sélection (2,5 mM CaCl2, MgCl2 5 mM dans le 1X tampon phosphate salin, pH 7,4, GIBCO) et incuber pendant 3 min à 37 ° C, puis laisser à température ambiante (RT) pendant 10 min.
- Passez à travers une colonne contenue Ni-NTA agarose-perles (QIAGEN) pré-lavés avec le tampon de la sélection, puis garder à température ambiante jusqu'à utilisation.
3.2.2. Préparation de Ni-NTA agarose-Bead Bound S100B à RT
- Isoler 400 ul de billes d'agarose Ni-NTA pendant 3 secondes et jeter le surnageant.
- Laver les billes avec 400 ul de tampon de liaison (50 mM Na 2 HPO 4-NaH 2 PO 4, pH 7,2, NaCl 150 mM) par un léger pipetage 5 fois, puis spin-down et jeter le surnageant.
- Répétez l'étape 2 fois.
- Ajouter 400 ul de purifier S100B (5 ug / uL, en suspension dans le tampon de liaison) et délicatement la pipette 5 fois toutes les 3 min pour un total de 15 min.
- Isoler et jeter le surnageant.
- Laver les billes S100B lié avec 400 uL de tampon de liaison par un léger pipetage 3 fois, puis spin-down et jeter le surnageant.
- Répétez l'étape 6 deux fois.
3.2.3. Sélection de S100B lié aptamères
- Transférer le + 32 - et 30 +-fragments de la 3.2.1 à la S100B perles assorties.
- Incuber pendant 15 minutes et mélanger délicatement toutes les 3 min par un léger pipetage.
- Laver le complexe ADN-S100B avec 800 uL de tampon de liaison par un léger pipetage, puis spin-down et jeter le surnageant.
- Répétez l'étape 3 deux fois.
3.2.4. Récupération des aptamères S100B-sélectionnés
- Ajouter 200 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), faire chauffer 3 min à 85 ° C, vortex et spin 1 min vers le bas, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube.
- Répétez les étapes 1 fois, et de combiner les surnageants.
- Purifier l'sélectionnée fragments d'ADN comme des étapes par des publications antérieures 9-12 (11, 12).
3.2.5. TOPO clonage et l'analyse par séquençage pour l'identification de séquences consensus aptamères
- Clone la ronde 10 ème sélectionné des produits de PCR ipas pCR2.1-TOPO vecteur (par Invitrogen). Le clonage supplémentaire peut être fait que d'autres sélections sont effectuées.
- Séquence 40-50 colonies isolées avec M13 amorce sens (nous utilisons le Core Facility génétique moléculaire au Centre Hershey Medical).
- Aligner les séquences sélectionnées à l'aide de Informax Vector NTI (Invitrogen).
- Déterminer les séquences consensus fondé sur les alignements.
- Consensus aptamères ont ensuite acheté des Technologies de l'ADN intégré.
3.3. Essais en sandwich avec des paires de reliure aptamères sélectionnés
3.3.1. Format de biopuces utilisant marqués par fluorescence 2 ème aptamères.
- Consensus 1 er aptamères ont été synthétisés avec un fragment 5'-amineC6. Ils ont été suspendus dans un tampon de l'impression à une concentration finale de 15 uM et déposées sur des lames Activé Codelink (GE Healthcare / Amersham Biosciences) en utilisant une Apogent Découvertes MicroGrid Arrayer dans l'ADN Microarray installation PSU, University Park), suivant des protocoles Codelink recommandée. Chaque diapositive a été imprimé avec 12 tableaux.
- L'hybridation a été effectuée dans un 2 x 8 cassettes de format hybridation Microarray (Il Array, Telechem International). La cassette a été scellé à l'aide Microarray sans nucléase feuille d'étanchéité adhésive (AlumaSeal II, les produits de la recherche internationale) pour empêcher l'évaporation.
- Protéines S100B a été dilué dans du PBS à la concentration appropriée dans 70 ul et appliquée dans les puits de la cassette de biopuces. Liaison aux aptamères imprimé sur la diapositive Codelink été pendant 1 heure à température ambiante. Les puits de la cassette ont été lavés puis individuellement 3X avec PBS + 5 mM MgCl 2 (PBSM), et l'excès de tampon de lavage a été effacé. Les aptamères marqués par fluorescence ont été dilués dans PBSM à 0,125 uM dans 70 ul, puis chauffé à 85 ° C pendant 3 minutes puis 3 minutes sur la glace. Les aptamères ont été appliqués aux puits de la cassette de puces à ADN, et mis à incuber pendant une heure à température ambiante. Des puits ont été lavés à nouveau individuellement 3X avec PBSM. La cassette a été ensuite démonté, annonce toute la lame a été rincée dans PBSM. La lame a été ensuite soigneusement séchée par centrifugation, et numérisées à l'aide d'un balayage Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).
3.3.2. Dérivatisés format de nanofils en utilisant 2 ème aptamères couplé à 50 nm AuNPs
Or NWS (~ 5 mm de longueur, 320 nm de diamètre) ont été synthétisés par électrodéposition galvanostatique dans les membranes poreuses d'alumine suivant des protocoles déjà publiés (13, 14). Lors de la dissolution de la membrane poreuse, les nanofils ont été remises en suspension dans 1 ml d'éthanol.
Comme indiqué précédemment, l'ADN a été acheté chez DNA Technologies intégrées. Les nanoparticules d'or (50 nm) ont été achetés auprès de Ted Pella. L'ADN a été clivé avec thiolées 100 mM de DTT dans 0,1 M pH 8,3 phosphate de sodium pendant une heure et ensuite purifiée dans un Centri-spin 10 colonne.
L'attachement à l'aptamère NWS or et les IP
Une partie aliquote de 50 uL de nanofils Au a été placé dans un tube de 0,5 ml centrifugeuse antiadhésive et rincé dans un tampon phosphate 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4. L'ADN à la thiolé extrémité 5 '(avec une entretoise de 10 T à l'extrémité 5') a été ajouté à une concentration finale de 0,4 uM aux fils. L'échantillon a été vortexé pendant 30 min puis rincés par centrifugation (8100 g) trois fois avec le tampon phosphate 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4 et trois fois avec un tampon phosphate 50 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,2. Les fils revêtus d'ADN ont été remises en suspension dans 100 ul de tampon pour diluer de moitié.
ADN dérivés AuNPs ont été préparés en ajoutant 50 pl 100 mM 2 ème aptamère (avec une entretoise de 10 T à l'extrémité 5 ') à 1 ml AuNPs 50 nm et chauffée à 37 ° C pendant une heure. Après un échauffement, 10 mM de tampon phosphate de sodium, NaCl 1M, pH 7,4 a été ajouté (25 uL deux fois, puis 100 ul, 150 pi et 128 uL) à intervalles de 0,5 heure. Les conjugués ont été laissés sur un bloc de 37 ° C pendant la nuit la chaleur avant de l'utiliser. Les échantillons ont été rincés trois fois avec un tampon phosphate 50 mM, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Conjugués ont été remises en suspension dans 120 ul de tampon.
Hybridation sandwich sur le NWS
Fils revêtus d'ADN, 1 ul diluée, ont été ajoutés au tampon dans les tubes PCR. S100B protéines ou de protéines de contrôle HTRA1 (1 ug / uL) a été ajouté pour une concentration finale de 1 uM dans un tampon de 50 uL (~ 10-12 molécules de protéine ajoutée par nanomètre carré de surface de nanofils Au). Les échantillons ont été vortexé ~ 2 heures. Fils ont été rincés par centrifugation (8100 g) trois fois avec un tampon phosphate 50 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,2 et ont chacun été remis en suspension dans 20 pl AUNP / ADN conjugués. Les fils ont été vortexés dans les conjugués pendant 2 heures, puis on rince 5x par centrifugation (1300 g) avec un tampon phosphate 50 mM, MgCl2 5 mM, pH7,2 pour enlever l'excès les nanoparticules. Les échantillons ont été remis en suspension dans 20 pl de tampon et séché sur des tranches de silicium Au couché pour FE-SEM analyse.
FE-SEM images des nanofils ont été obtenus en utilisant une émission de champ Leo 1530 microscope électronique à balayage utilisant une source d'électrons Schottky à émission de champ à une tension 5.00 kV d'exploitation.
4. Les résultats représentatifs
Figure 1. Protocoles L'amorce 5'-frais (PF 1) et Primer-Free (PF 2).
(A) Le protocole de sélection PF 1 aptamère ADN. Les oligonucléotides bibliothèque sont recuites ensemble, et soumis à une amplification par PCR pour produire une banque d'ADN double brin (a). L'extrémité 5 'amorce-libre (PF 1) région de hasard dans les bibliothèques PF ADN simple brin est préparé par Nt.BstNBI / Nt.BbvCI digestions (sites de clivage sont indiqués par des flèches rouges) et de gel de purifications et de l'auto -pont (flèche noire) est isolé par purification sur gel (b). Après la sélection (c), les séquences sélectionnées (désigné PS30-CC) sont hybridées avec leurs oligomères correspondant et l'auto-pont et ligaturé à re-générer les régions apprêt préalablement retiré. A ce stade, les amorces sont introduites qui contiennent un promoteur Sp6 à l'extrémité 3'-(d). Ceci est ensuite utilisée pour transcrire l'ARN contenant les régions sélectionnées (e). Enfin, l'ARN est alors exclusivement ré-amplifié (la matrice d'ADN est digéré) par RT-PCR (f), et les certains sous-bibliothèque est prêt pour la prochaine ronde de sélection.
(B) Le protocole de sélection PF 2 aptamère ADN. Les oligonucléotides bibliothèque sont recuites ensemble et soumis à une amplification par PCR pour produire une banque d'ADN double brin (a). La région d'amorce libre (PF 2) choisis au hasard dans la bibliothèque d'ADN simple brin PF est préparé par Nt.BstNBI / BspMI digestions (sites coupés sont notées avec des pointes de flèches) et la purification de gel. L'auto-pont est isolé soit de la PF 1 protocole et / ou par simple digestion de la bibliothèque à partir de Nt.BstNBI (b), couplée à la purification de gel. Après la sélection (c), les séquences sélectionnées (désigné PS30) sont hybridées avec leurs oligomères correspondant et l'auto-pont, et ligaturé pour régénérer les régions apprêt préalablement retiré. Comme dans PF 1, les amorces sont introduites qui contiennent un promoteur Sp6 à l'extrémité 3 '(d). Ceci est ensuite utilisée pour transcrire l'ARN contenant les régions sélectionnées (e). L'ARN est alors exclusivement réamplifiés par RT-PCR (f), et les certains sous-bibliothèque est prêt pour la prochaine ronde de sélection.
Figure 2. Représentation schématique et les résultats expérimentaux / réduction à la pratique du protocole de sélection de PF. Désignés étapes correspondent à celles décrites dans la figure 1. Après digestion de la bibliothèque PF construite par PCR (étape a) avec des endonucléases de restriction (comme indiqué), les produits digérés ont été séparés par PAGE sur un gel de 10% en conditions dénaturantes. Les fragments correspondant obtenu avec le PF 1 et PF protocoles de sélection 2 sont représentées (étape b). Après la sélection (étape c), les aptamères fixés sont hybridées avec leurs oligomères correspondant et l'auto-pont, et ligaturé pour régénérer les régions apprêt préalablement retiré. À l'extrémité 3 ', les amorces sont introduites qui contiennent un promoteur Sp6 à l'extrémité 3' (étape D) 32. ARN marqué au P ont été transcrits en utilisant des produits ligaturés de 1, 0,5, 0,25, 0,125 ul de 5 réactions ul, et ont été séparées par PAGE sur des gels de 6% en conditions dénaturantes (e étape). Les transcriptions ont ensuite été traités à la DNase au enlevé les régions non sélectionnées ADN aléatoire, une transcription inverse en ADNc, puis réamplifiés pour les cycles de PCR 7, 14, 21 ou 28. Les produits ont été séparés par PAGE sur des gels de 8% sous conditions non-dénaturantes. Le fragment de 66 nt représente le produit sur toute la longueur contenant les sélectionnés PS30 PS30-CC et les séquences comme re-intégrées dans les séquences 5 'et 3' flanquant. La migration des marqueurs PhiX174/HinfI est représentée à gauche (étape f). Les contrôles incluent une omission de la transcription (RT) étape inverse. Une petite quantité de produit dans de tels échantillons pouvaient être vus à nombre de cycle élevé, ce qui vraisemblablement ne peut être complètement éliminé avec un deuxième (ou prolongé) étape de digestion par la DNase.
Figure 3. Pouvoir de fixation de aptamères sélectionnés et leur utilisation par paires dans un format sandwich.
A. dépendant de la concentration 32 P-aptamères de liaison pour la détermination de Kd. Les aptamères sont 5'-end marqué à l'aide du G-32 P-ATP (3000Ci /mmol, ~ 10 mCi) et la T4 polynucléotide kinase (New England Biolabs), et la liaison a été déterminée comme décrit.
B. 5'-amine-dérivatisé 1 er aptamères ont été couplés à Codelink microarrays. Purifié S100B protéine a été lié à l'aptamère 1 er, les lames ont été rincées à fond, et AlexaFluor546 marqué 2 ème aptamère a été lié à l'aptamère 1 er: les complexes S100B. Après un rinçage à travers, par fluorescence a été quantifiée en utilisant un scanner ScanArray.
C. 5'-thiol dérivatisés 1 er aptamères ont été couplés à l'aide de nanofils Au standard de la chimie thiol. 2 ème aptamères ont été couplés à 50 nm AuNPs de la même manière. Purifié S100B protéines (à gauche) ou protéine purifiée de contrôle HTRA1 (à droite) a ensuite été liée d'abord à la nanofils dérivés. Après rinçage, 2 ème aptamère-50 AuNPs nm ont été ensuite lié à la 1 ère aptamère-nanofils: complexes S100B. Après un rinçage à travers, complexes sandwich liés ont été visualisés à l'aide à émission de champ microscopie électronique à balayage. Barres d'échelle = 1 um.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions Paul Craig à l'installation de base biopuces pour son aide. Ce travail a été soutenu par le NIH / NCI octroi # CA118591 du Programme IMAT. SLD reconnaît également un espace de Pennsylvanie Grant Consortium bourse de soutien financier. Cette publication a été également soutenu par la Pennsylvania State University Matériaux Institut de recherche Nano réseau de fabrication et la National Science Foundation Accord de coopération n ° 0335765, réseau national d'infrastructure nanotechnologie, avec l'Université Cornell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | |||
| HotMaster TAQ DNA Polymerase | 5 PRIME | ||
| dNTP Mix | Sigma-Aldrich | ||
| Acrylamide | Fisher Scientific | ||
| UltraPure 10X TBE Buffer | Invitrogen | ||
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | ||
| TEMED | Fisher Scientific | ||
| PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker | Promega Corp. | ||
| Ethidium Bromide | |||
| α-32P-dCTP | |||
| Phenol:ChCl3:IAA | Ambion | ||
| NaCl | |||
| Ethanol | |||
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | ||
| Urea | Fisher Scientific | ||
| Photographic Film | ECE Scientific | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| CaCl2 | GIBCO, by Life Technologies | ||
| MgCl2 | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | ||
| Polypropylene Column | Qiagen | ||
| NaHPO4 | |||
| NaAc | |||
| Detroit-551 cells | |||
| SK-MEL-31 cells | |||
| MEM | |||
| TrypLE Express | GIBCO, by Life Technologies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Promega Corp. | ||
| Sp6 RNA Polymerase | Promega Corp. | ||
| RNase-Free DNase I | Promega Corp. | ||
| RNase Inhibitor | Promega Corp. | ||
| SensiScript Reverse Transcriptase | Qiagen | ||
| pCR-2.1-TOPO Vector | Invitrogen | ||
| DH5α Compotent Cells | Invitrogen | ||
| Plasmid Mini Kit | Qiagen | ||
| Vector NTI | Invitrogen | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | ||
| γ-32P-ATP |
References
- Kulbachinskiy, A. V. Methods for selection of aptamers to protein targets. Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).
- Mairal, T. Aptamers: molecular tools for analytical applications. Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).
- Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers. Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).
- Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX. Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).
- Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection. Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).
- Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX. Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).
- Wen, J. D., Gray, D. M. Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX. Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue. Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).
- Pan, W. H., Clawson, G. A. Primer-free aptamer selection using a random DNA library. Methods Mol Biol. , Forthcoming (2009).
- Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries. BioTechniques. 44, 351-360 (2008).
- Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B.
- JC, H. ulteen, CR, M. artin A general template-based method for the preparation of nanomaterials. J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).
