परमाणु परिवहन के एकल अणु इमेजिंग

Summary

एकल अणु माइक्रोस्कोपी परमाणु परिवहन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान approch.

Abstract

पिछले एक दशक से अधिक जैविक प्रतिक्रियाओं को समझने में एक महान लाभ उठाने के एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण की उपयोगिता सिद्ध किया गया है. उच्च अस्थायी और स्थानिक कोशिकाओं के भीतर गहरे संकल्प के साथ आणविक मुलाकातों की जांच के कारण स्वाभाविक कमजोर संकेतों व्यक्तिगत अणुओं से उत्पन्न होने वाली चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. यांग एट अल द्वारा हाल ही में काम करता है. दिखा दिया है कि संकीर्ण क्षेत्र epifluorescence माइक्रोस्कोपी nucleocytoplasmic परिवहन के एकल अणु के स्तर पर दृश्य की अनुमति देता है. एकल अणु दृष्टिकोण संकेत निर्भर और स्वतंत्र कार्गो अणुओं के लिए परमाणु परिवहन समय और दक्षता के रूप में महत्वपूर्ण कैनेटीक्स, के द्वारा प्राप्त किया गया है. यहाँ हम methodological दृष्टिकोण के लिए 0.4 एमएस और 12 एनएम के एक बेहतर spatiotemporal संकल्प के साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन. सुधार के प्रस्ताव हमें परमाणु ताकना परिसरों (एनपीसी) के माध्यम से अर्द्ध बरकरार कोशिकाओं में क्षणिक सक्रिय परिवहन और निष्क्रिय प्रसार की घटनाओं पर कब्जा करने के लिए सक्षम होना चाहिए. हम इस विधि कोशिकाओं के भीतर अन्य बाध्यकारी और तस्करी की घटनाओं elucidating में इस्तेमाल किया जा करने के लिए उम्मीद है.

Protocol

1. एक अणु के प्रयोग के लिए सेल प्रणाली की तैयारी

1. अग्रिम में कम - से - कम एक हफ्ते, एक शेयर से 37 पर विगलन डिग्री सेल्सियस और 5 एमएल मीडिया के साथ एक 25 ^सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में डाल द्वारा HeLa सेल लाइन का एक ताजा संस्कृति शुरू करने के लिए, 37 कोशिकाओं सेते डिग्री _{सेल्सियस} के भीतर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर 24 घंटे और कम से कम 3 एक बार यह विभाजन क्रम में कोशिकाओं के लिए एक इष्टतम स्थिति प्रदान करने के लिए. हालांकि कोशिकाओं उनकी विकास दर की प्रवृत्ति के कारण नीचे काफी धीमी गति से 20 से अधिक बार विभाजित नहीं किया जा चाहिए. HELA कोशिकाओं पहले आनुवंशिक GFP (हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन) परमाणु लिफाफा ताकना झिल्ली प्रोटीन 121 पोम के लिए जुड़े हुए थे इंजीनियर. यह परमाणु लिफाफा के एक सटीक स्थानीयकरण के लिए आवश्यक है.
2. प्रयोग से पहले एक दिन, एक एक अणु के प्रयोग के लिए इरादा कोशिकाओं को एक autoclaved कवर एक बाँझ पेट्री डिश में रखा पर्ची पर फैल जाना चाहिए. coverslip DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ पूरक 4.5 छ / एल ग्लूकोज, 862 मिलीग्राम / एल GlutaMAX - मैं, 15 मिलीग्राम / एमएल phenol लाल, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100μg/mL में निलंबित किया जाना चाहिए स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% नवजात बछड़े सीरम. एक संस्कृति की मात्रा कवर पर्ची प्रति 1ml, समान रूप से सभी सतह पर वितरित किया जाना चाहिए. कवर फिसल जाता है के साथ इन पेट्री डिश तो _सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा जाता है और प्रयोग करने के लिए पहले 24 घंटे के लिए रखा. एक सेल संस्कृति के लिए आदेश में एक एक अणु प्रयोग के लिए उपयुक्त हो सकता है कवर पर्ची पर confluency सेल 70% से अधिक नहीं धोने और buffers परमाणु परिवहन के दौर से गुजर ब्याज के प्रोटीन के लिए एक अच्छा स्वतंत्रता प्रदान करना चाहिए.
3. प्रयोग के दिन, प्रवाह कक्षों उनका कहना है एक शीर्ष कवर spacers के रूप में दो सिलिकॉन तेल की लाइनों के साथ एक साथ पर्ची के द्वारा निर्माण किया गया. यह यकीन है कि कोशिकाओं तैयारी के दौरान बाहर सूखी नहीं बनाना आवश्यक है. हम आम तौर पर एक कवर पर बना दो कक्षों के प्रयोग के लिए दो अलग अलग परिस्थितियों की अनुमति पर्ची पसंद करते हैं. शीर्ष कवर गिलास को कवर एक हीरे की चाकू से कटौती के लगभग 6mm2 उल्टा Kimwipe पर रखा गया है पर्ची के छोटे slivers निकल जाता है. सिलिकॉन तेल की दो लाइनें पतले वह एक 10 एमएल प्लास्टिक सिरिंज कि ​​एक विंदुक कसकर Parafilm के साथ संलग्न तेल मनका के आकार को नियंत्रित करने के लिए टिप के साथ कवर फिसल जाता है के किनारों के साथ रखा गया है.
4. HeLa सेल लेपित स्लाइड था तो ड्रिप - सूखे और घर machined एल्यूमीनियम फ्रेम में गोंद के रूप में तेल के साथ बढ़ - गुस्सा, जो माइक्रोस्कोप नमूना धारक में स्लाइड पकड़ सेवा.
5. तेल की दो लाइनों के साथ शीर्ष कवर फिसल जाता है तो बताया चिमटी और फिर सेल लिपटे स्लाइड अधिक औंधा के साथ उठाया, एक प्रवाह कक्ष के गठन. एक अपेक्षाकृत फर्म लगाव coverslip के greased किनारों पर धीरे दबाकर किया गया था.
6. चूंकि हम एक स्लाइड सेल लेपित पर दो अलग - अलग कक्षों बनाया यह आवश्यक है एक अच्छा पार संदूषण को रोकने के लिए सील प्रदान. इस प्रयोजन के लिए सिलिकॉन तेल के कई लाइनों के ऊपर से स्लाइड के नीचे कोठरियों के बीच में लागू किया गया के अलावा सील. कक्षों की बाहरी पक्षों पर तेल की कई लाइनें भी डाल रहे थे.
7. DMEM मीडिया तब प्रवाह चैम्बर के लिए जोड़ा गया है बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए. समाधान प्रवाह एक छोटा सा टुकड़ा फिल्टर पेपर के द्वारा प्रोत्साहित किया गया था प्रवाह कक्षों के बाहर निकलने की ओर से द्रव बाहर अवशोषित. स्थिर हाथ के साथ, समाधान micropipette द्वारा एक हाथ से प्रवाह चैम्बर के एक तरफ एक साथ जोड़ा जा सकता है, और फिल्टर पेपर द्वारा दूसरे पक्ष पर अवशोषित.
8. निर्माण के बाद, स्लाइड के नीचे गीला इत्तला दे दी - कपास झाड़ू के साथ धोया था, पानी के साथ दो बार, और तब दो बार 100% इथेनॉल के साथ.
9. एक बार स्लाइड खुर्दबीन पर मुहिम शुरू की है, कोशिकाओं 2 X 25 μL आयात बफर (20 मिमी Hepes, 110 मिमी KOAc, 5 मिमी NaOAc, 2 मिमी MgOAc, 1 मिमी EGTA, पीएच 7.3) के साथ धोया. कोशिकाओं तो ~ 2 एक्स 25 μL आयात बफर में 40 digitonin / μg एमएल के साथ 2 मिनट के लिए permeabilized और 2 एक्स 25 μL आयात बफर (20 मिमी HEPES, 110 मिमी KOAc, 5 मिमी NaOAc, 2 मिमी MgOAc, 1 मिमी के साथ फिर से धोया 360 केडीए); EGTA, पीएच 7.3) 1.5% polyvinylpyrrolidone (PVP के साथ पूरक. यह एक उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करके वास्तविक समय में permeabilization की निगरानी के लिए आवश्यक हो सकता है. PVP सभी आयात बफर समाधान में शामिल किया गया था digitonin बाद नाभिक के आसमाटिक सूजन को रोकने के लिए. बरकरार नाभिक, एक नियंत्रित cytoplasmic वातावरण के साथ साथ एक बहुत सरल परिवहन प्रणाली है कि हमें जटिल कदम से परमाणु परिवहन कदम स्पष्ट करने की अनुमति देता है प्रदान करता है. पिछला पहनावा और एकल अणु प्रयोगों कि प्रणाली में आयोजित परमाणु परिवहन में महान अंतर्दृष्टि प्रदान की है.

2. परमाणु परिवहन के प्रयोग के लिए आवश्यक प्रोटीन की तैयारी

1. एक पारंपरिक जीवाणु परिवर्तन के माध्यम से ई. कोलाई (JM109) के विशेष उपभेदों के क्रम में के लिए जिम्मेदार जीन overexpress इंजीनियर थेब्याज की abovementioned प्रोटीन के उत्पादन और स्टॉक में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है (एनएलएस - 2xGFP के लिए हम Invitrogen pTrcHisB वेक्टर द्वारा इस्तेमाल किया). फ्लोरोसेंट या कार्गो ई कोलि कोशिकाओं व्यक्त प्रोटीन की जमी शेयरों की एक loopful या ~ 50 μL लेग मीडिया के 5ml एम्पीसिलीन के 5μL के अलावा के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं (1000 यू) और 37 पर रातोंरात मिलाते ° 225 rpm सी के साथ बड़े हो aerobically.
2. 24 घंटे के बाद संतृप्त संस्कृति के 500 μL लेग मीडिया के 500 एमएल में स्थानांतरित कर रहा है और 5-6 घंटे के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में हिल के अलावा 250 μL IPTG (Isopropyl thiogalactopyranoside-_-D-1) के बाद और दूसरे के लिए incubated 5-6 घंटे. यह आवश्यक है क्योंकि IPTG एक लैक्टोज metabolite है कि चलाता लाख operon, जहां lacZ जीन ब्याज और IPTG के जीन के साथ बदल दिया है की प्रतिलेखन तो जीन अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है है.
3. संस्कृति तो 15 मिनट के लिए 12,000 rpm पर है ठंडा अपकेंद्रित्र उच्च गति में घूमती है और सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है. कोशिकाओं तो CelLytic (प्रोटीन है कि आत्मीयता शुद्धि और विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं तेजी से और कुशल निकासी में CelLytic बी परिणाम.) बी मात्रा एक गोली के 1 ग्राम प्रति 10 एमएल पर आधारित होना चाहिए के 40 एमएल में resuspended हैं. Mercaptoethanol के 28 μl डाइसल्फ़ाइड बांड और phenylmethanesulphonyl फ्लोराइड के 400 μl तोड़ने के सेल lysis के बाद ब्याज की प्रोटीन को पचाने से proteases को निष्क्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है. एक "protease कॉकटेल" भी जोड़ा जाता है (0.2 मिलीग्राम / एमएल pepstatin ए 0.2 मिलीग्राम / एमएल leupeptin के 400 μL 400 μL, 2 मिलीग्राम / एमएल trypsin अवरोध करनेवाला के 400 μL) करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रोटीन के अर्क के विश्लेषण से पहले लक्ष्य के लिए नीचा नहीं ब्याज की. हम तो 400 μL 1M imidazole जोड़ने, टैग नी क्रोमैटोग्राफी और DNase मैं स्तंभ 1mm में मोतियों की सतह से जुड़ी आयनों, 5 phosphodinucleotide और oligonucleotide में अवांछित एकल और डबल असहाय डीएनए नीचा करने के लिए प्रयोग किया जाता करने के लिए बाध्य प्रोटीन elute करने के लिए प्रयोग किया जाता है टुकड़े.
4. 60 मिनट के लिए ठंडा अपकेंद्रित्र में 10000 rpm पर प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त समय, स्पिन की अनुमति अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण हिलाओ. सतह पर तैरनेवाला हार्वेस्ट और क्रोमैटोग्राफी के लिए तैयार करने में 3 मिनट के लिए अधिकतम गति पर microfuge अपकेंद्रित्र ट्यूबों में और कताई lysis बफर के साथ धोने, कताई और वाशिंग जब तक मिश्रण है दोहरा द्वारा नी NTA (निकल nitrilotriacetic Qiagen द्वारा एसिड Superflow) के साथ जलसेक प्रदर्शन किसी भी नीले रंग की स्पष्ट है. धीरे धीरे 60 मिनट के लिए बर्फ पर एक अंधेरे कंटेनर में परिणामी मिश्रण हिलाओ.
5. कॉलम क्रोमैटोग्राफी निम्नानुसार 12 भिन्न के माध्यम से बह प्रदर्शन. पहला अंश के माध्यम से 10 एमएल पिछले चरण में नी NTA के साथ मिश्रित सतह पर तैरनेवाला के एक प्रवाह है. दूसरा lysis बफर के 10 एमएल (50 मिमी ना फास्फेट, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, पीएच 8.0), बफर के तीसरे 10 एमएल (10 मिमी imidazole, 100 मिमी NaCl, पीएच 8.0), चौथे और बाकी हैं elution बफर की 0.5 एमएल (, 250 मिमी imidazole, 100 मिमी NaCl, पीएच 8.0)
6. एसडीएस पृष्ठ polyacrylamide जेल की तैयारी और एक अंश के 4 μL और 5X एस.बी. (300mm Tris 6.8, 25% BME, एसडीएस 10%, 50% ग्लिसरॉल) के 1 μL मिश्रण से हमारे नमूने तैयार. मानक के लिए हम Invitrogen द्वारा 100 केबी डीएनए सीढ़ी का इस्तेमाल किया. लोड हो रहा है इससे पहले कि हम 5 मिनट के लिए हमारे नमूने उबला हुआ. लोड करने के बाद हम 120V पर 60 मिनट के लिए जेल भागा. फिर हम, दाग, destained और अंत में 2 घंटे के लिए 80 सी में एक विशेष जेल सुखाने की मशीन में सूख.
7. हम तो जेल पर परिणाम देखा है और भिन्न है कि सबसे अच्छा परिणाम सामने आए स्थित है. हमारे हित के प्रोटीन पर निर्भर करता है, बैंड एक प्रोटीन के आकार में क्रमशः स्थित चाहिए. इस अंश MonoQ और Superdex 200 (Amersham Pharmacia) के साथ आगे प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए चयनित किया जाना चाहिए.
8. एकाग्रता Nanosep फिल्टर में 10K के एक ध्यान में लीन होना आकार के साथ सबसे केंद्रित भिन्न 5 मिनट के लिए 14 rpm पर कताई यह elution बफर के साथ धोने हर बार द्वारा किया जाता है. यह अंतिम BSA परख आगे प्रोटीन लेबलिंग प्रक्रिया के लिए प्रोटीन का उपयोग एकाग्रता का निर्धारण आवश्यक है.
9. आंतरिक हरी प्रतिदीप्ति एनएलएस - 2xGFP अपनी तस्वीर स्थिरता गरीब और सेल autofluorescence के साथ छा स्पेक्ट्रम के कारण परमाणु परिवहन के एकल अणु इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया कर सकते हैं. इस प्रकार, हम TCEP (tris 2 के साथ कम करने के बाद एक सिस्टीन प्रतिक्रियाशील कार्बनिक डाई (Alexa555 या आण्विक जांच से 647 maleimide Alexa) के एक कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 50 मिमी सोडियम फास्फेट, 150 मिमी NaCl में अधिक के साथ कार्गो अणुओं लेबल - carboxyethyl) 20 मिनट के लिए. प्रतिक्रियाओं 2 - mercaptoethanol के साथ quenched थे, और प्रोटीन समाधान करने के लिए स्वतंत्र डाई हटाने dialyzed थे.

3. एकल अणु माइक्रोस्कोपी

1. हमारे खुर्दबीन सेट अप एक IX81 ओलिंप 1.4 एनए 100x उद्देश्य तेल विसर्जन (UPLSAPO 100XO, ओलिंप) के साथ सुसज्जित, एक 35 मेगावाट 633 एनएम वह-NE लेजर (Melles Griot), GFP फिल्टर के साथ एक पारा लैंप सेट, पर एक भी शामिल है चिप गुणा लाभ आरोप डिवाइस युग्मित (झरना 128 +, नट वैज्ञानिक) कैमरा और वेंडाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए ई Slidebook सॉफ्टवेयर पैकेज (इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार). एक ऑप्टिकल हेलिकॉप्टर (न्यूपोर्ट) लेजर उत्तेजना के एक मोड पर बंद उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. GFP और Alexa647 प्रतिदीप्ति एक पारा दीपक और 633 एनएम लेजर क्रमशः से उत्साहित किया गया था. हरे और लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एक ही उद्देश्य है, एक dichroic (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) फिल्टर और एक उत्सर्जन (फिल्टर NF01-405/488/561/635-25X5 द्वारा छनित द्वारा एकत्र की गई थी. 0, Semrock) और एक समान सीसीडी कैमरा के द्वारा imaged.
2. एकल अणु प्रयोगों में, हम एकल कार्गो अणु के प्रतिदीप्ति photobleaching समय सक्षम परिवहन समय की तुलना में अब. Photobleaching समय निर्धारित करने के लिए, 0.1 एनएम कार्गो अणुओं एक गिलास कवर पर चढ़ाया जाता है पर्ची और गैर विशिष्ट अवशोषण के कारण 30 मिनट के बाद स्थिर बन. फिर, प्रतिदीप्ति का समय बेशक मापा जाता है. ब्याज photobleach बार के प्रोटीन पर निर्भर करता है maleimides, इसलिए रोशनी की तीव्रता और रोशनी के क्षेत्र के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम cysteins की संख्या के आधार पर भिन्न हो क्रम में एक प्रारंभिक photobleaching प्रेरित नहीं समायोजित किया जाना चाहिए और कि कार्गो Alexa 647 प्रदर्शन के साथ लेबल अणुओं बीमा cargos NPCs के साथ बातचीत से अब के लिए प्रतिदीप्ति.
3. Permeabilized कक्षों में आयात प्रयोगों के लिए, कार्गो और आवश्यक परिवहन cofactors के साथ जोड़ा गया था. ठेठ आयात कार्गो प्रतिक्रियाओं 1 मिमी GTP, 0.5 सुक्ष्ममापी निहित importin, 0.5 सुक्ष्ममापी importin-1, 2 सुक्ष्ममापी दौड़ा और एक सुक्ष्ममापी परिवहन सुविधा और निष्क्रिय परिवहन के लिए 0.1 एनएम 10KDa Dextran के लिए NTF2 .. प्रतिदीप्त कार्गो सांद्रता थोक प्रयोगों में> 100 एनएम थे, और एक अणु assays के लिए 100 PM ~. इन सांद्रता में,> कार्गो का 99% importin और importin साथ परिसरों फार्म की उम्मीद थी. परिवहन दर (यदि केवल रिश्तेदार दरों महत्वपूर्ण थे) epifluorescence या confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (अगर निरपेक्ष दरों वांछित थे) द्वारा नजर रखी थी.
4. पहले परमाणु लिफाफा की स्थिति का व्यापक क्षेत्र epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP फिल्टर का एक सेट के साथ एक एचबीओ पारा दीपक उलझाने के पूर्वोत्तर के एक तस्वीर लेने के द्वारा निर्धारित किया गया था. एक पंक्ति या स्तंभ के भीतर पिक्सेल तीव्रता सीधा पूर्वोत्तर के लिए लगभग गाऊसी साथ फिट थे. पिक्सेल तीव्रता के एक विशेष सेट के लिए गाऊसी के शिखर पदों कि पंक्ति और स्तंभ के लिए पूर्वोत्तर की स्थिति माना जाता था. ऐसे Gaussians की एक श्रृंखला के शिखर पदों तो एक दूसरी डिग्री बहुपद के साथ फिट थे, पूरी छवि के भीतर पूर्वोत्तर के रास्ते उपज.
5. एक बार पूर्वोत्तर स्थानीयकृत है, यह आवश्यक है सभी एक 633 लेजर वह-NE एनएम के उपयोग autofluorescence के छुटकारा जब तक यह पूरी तरह से photobleached है, आम तौर पर 60 सेकंड के लिए पर्याप्त है.
6. नमूना अणुओं तो PVP की 1.5% समाधान में रखा जाना चाहिए और मिश्रण 25 एल के एक मात्रा में प्रवाह चैम्बर में जोड़ा और तब कक्ष के माध्यम से फिल्टर पेपर के एक बाती लगाने घसीटा. एक बोलना आयात कार्गो प्रोटीन के परमाणु लिफाफा स्थानीयकरण के बाद सही permeabilized कोशिकाओं के अलावा देखभाल पर लिया जाना चाहिए के बाद से ध्यान आसानी से किसी भी जोरदार आंदोलन से बाधित किया जा सकता है.
7. जैसे ही कार्गो अणुओं के रूप में जोड़ा है, 633 एनएम वह-NE लेजर transiting अणुओं के परिवहन trajectories रोशन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Photobleaching लेजर की एक उच्च शक्ति घनत्व, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर photobleached एकल अणुओं के एक नए हिस्से पूर्वोत्तर दृष्टिकोण की अनुमति के कारण से बचने के एक ऑप्टिकल हेलिकॉप्टर (न्यूपोर्ट) लगभग 5 हर्ट्ज पर लगे हुए किया जाना चाहिए. एकल अणु translocations के वीडियो की एक श्रृंखला के एक उच्च गति सीसीडी कैमरा है कि 2500 हर्ट्ज के लिए जा सकते हैं के साथ लिया जाना चाहिए.

4. प्रतिनिधि परिणाम

सही ढंग से प्रदर्शन किया, हमारे प्रोटोकॉल हमें एकल कार्गो permeabilized HeLa पोम 121 कोशिकाओं में परमाणु ताकना परिसर के साथ बातचीत के अणुओं के स्थानान्तरण का प्रदर्शन वीडियो की एक श्रृंखला लेने के लिए अनुमति दी. (चित्र 1). हम छवि के लिए बाहर सेट और digitonin - permeabilized HeLa stably GFP-POM121 व्यक्त कोशिकाओं में एनपीसी के माध्यम से dextran अणुओं के क्षणिक परिवहन कदम ट्रैक. कक्ष लेबल dextran अणुओं की कम सांद्रता के साथ incubated रहे थे. नाभिक के भूमध्यवर्ती विमान GFP प्रतिदीप्ति की हरे रंग की अंगूठी एक 488 एनएम पारा दीपक प्रकाश से उत्साहित का एक स्पष्ट छवि के साथ ध्यान में लाया गया था. GFP पूर्वोत्तर के एक लंबे समय जोखिम हमें सक्षम बनाता है एक उत्कृष्ट संकेत से शोर अनुपात (SNR) को प्राप्त करने के लिए पूर्वोत्तर के बीच विमान स्थानीयकरण है. पहले 10 केडीए dextran अणुओं के बारे में 20-40 एनएम के 500 या 1000 हर्ट्ज की एक का पता लगाने फ्रेम दर से एक स्थानिक संकल्प के साथ करने के लिए पूर्वोत्तर के माध्यम से लगभग 2 एमएस के भीतर फैलाना पाए गए. इस तरह spatiotemporal संकल्प एनपीसी है जो निष्क्रिय प्रसार के लिए और अधिक स्थानिक जानकारी को स्पष्ट करने के लिए पर्याप्त नहीं है के माध्यम से केवल एक को दो dextran अणुओं के प्रसार कदम पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है. एनपीसी के भीतर एक बेहतर spati के साथ dextran अणुओं की अधिक ठीक कदम पर कब्जाotemporal संकल्प, हम दो प्रमुख सुधार का आयोजन किया है: (i) के लिए 2500 हर्ट्ज की एक तेजी से पता लगाने फ्रेम दर अनुकूलन के लिए और अधिक ठीक प्रसार कदम पर कब्जा, और (ii) एक उच्च रोशनी ऑप्टिकल घनत्व को रोजगार के लिए एकल अणुओं से अधिक photons उत्तेजित प्राप्त करने के लिए एक उच्च स्थानिक संकल्प. ये सुधार हमें पूर्वोत्तर भर alexa647 लेबल dextran अणुओं के क्षणिक प्रसार के कई कदम पर कब्जा करने के लिए 633 एनएम लेजर प्रकाश द्वारा 12 एनएम और 400 एमएस के एक spatiotemporal संकल्प के साथ 100 किवॉ / ² सेमी के विकिरण में सक्षम है .

जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, dextran अणुओं की विशिष्ट परिवहन घटनाओं के अभी भी छवियों की एक श्रृंखला दर्ज किए गए. व्यक्तिगत transiting dextran अणुओं के स्थानिक trajectories पर नज़र रखने से, पूर्वोत्तर के माध्यम से प्रसार के ठीक कदम प्रतिष्ठित थे. हमने पाया है कि वहाँ पूर्वोत्तर के साथ बातचीत की घटनाओं के लगभग 30% हैं उद्भव और गंतव्य डिब्बों में मान्यता प्राप्त है. उनमें से, cytoplasm से पूर्वोत्तर चलती dextran अणुओं दो स्थलों: diffusing के बाद पूर्वोत्तर के माध्यम से नाभिक में अंत या cytoplasm के लिए वापस के साथ पूर्वोत्तर निर्यात की घटनाओं के लिए इसी तरह की परिस्थितियों हुई बातचीत के बाद कदम: dextran नाभिक से शुरू अणुओं cytoplasm दर्ज करें या पूर्वोत्तर के साथ बातचीत के बाद वापस नाभिक को फैलाना. इस तरह छवि श्रृंखला एनपीसी के संबंध में, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एनपीसी के माध्यम से अणुओं के समय ध्यान केन्द्रित पर अस्थायी जानकारी के साथ एकल अणुओं के स्थानिक स्थान पर जानकारी होती है. पूर्वोत्तर के क्षेत्र के आसपास dextran अणुओं के trajectories का विश्लेषण करके, परिवहन समय दक्षता, प्रवेश द्वार और आवृत्ति निर्धारित किया जा सकता है. हमारे काम में परिवहन समय आयात या निर्यात के समय के रूप में पहचाना जा सकता है है. वे औसत NPCs है कि आयात या निर्यात से गुजरना भीतर dextran अणुओं के समय ध्यान केन्द्रित के रूप में परिभाषित किया गया है. आयात या निर्यात दक्षता पूर्ण और निष्फल घटनाओं की राशि पर पूरा आयात या निर्यात घटनाओं के प्रतिशत के रूप में में परिभाषित किया गया था. आयात या निर्यात के प्रवेश द्वार आवृत्ति पूर्वोत्तर के साथ बातचीत के दौरान एक दूसरे अणुओं की संख्या दर्शाता है.

चित्रा 1 चयनित dextran अणुओं के माध्यम से पूर्वोत्तर की विशिष्ट परिवहन घटनाओं की वीडियो फ्रेम. (ए) एक घटना cytoplasm करने के नाभिक. Cytoplasm से शुरू कर दिया है, एक एकल dextran अणु (लाल मौके) पूर्वोत्तर (हरी पिक्सेल लाइन) के साथ बातचीत, और नाभिक में समाप्त हो गया. घटना (नीले लाइनों और खुले डॉट्स) के trajectories निर्धारित और पूर्वोत्तर (काले लाइन) के साथ आरोपित थे. हरे और लाल लाइनों cytoplasm और परमाणु पक्ष पर पूर्वोत्तर से 100 एनएम दूरी का प्रतिनिधित्व करते हैं. सी, cytoplasm. एन, नाभिक. स्केल पट्टी: 2 मिमी. (बी) एक cytoplasm करने के cytoplasm घटना. (सी) एक नाभिक को नाभिक घटना. (डी) एक नाभिक को cytoplasm घटना.

Discussion

ध्यान के प्रयोग के दौरान पूर्वोत्तर और एकल अणुओं की एक उचित colocalization बीमा लिया जाना चाहिए. यह भी एक उच्च संकेत शोर अनुपात प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब संकेत कम है गरीब लेबलिंग या photobleaching के कारण. स्थानीयकरण सटीक पृष्ठभूमि शोर (फोकस प्रतिदीप्ति, सीसीडी readout शोर, अंधेरे वर्तमान और अन्य कारकों से उत्पन्न होने वाली) के द्वारा सीमित है.