Single-molecule beeldvorming van de nucleaire transporten

Summary

Enkel molecuul microscopie Approach die nieuwe inzichten naar nucleaire transport.

Abstract

Het nut van single molecule fluorescentie microscopie aanpak is bewezen te zijn van een grote maken in het begrijpen van biologische reacties in het afgelopen decennium. Het onderzoek naar moleculaire interacties met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie diep in de cellen is gebleven uitdagend door de inherent zwakke signalen die voortvloeien uit de individuele moleculen. Recente werken van Yang et al.. aangetoond dat smalle veld epifluorescentie microscopie visualisatie van nucleocytoplasmic vervoer kan op de single molecule-niveau. Door de een-molecuul benadering, belangrijk kinetiek, zoals nucleaire transport tijd en efficiëntie, voor signaal-afhankelijke en onafhankelijke lading moleculen zijn verkregen. Hier hebben we beschreven een protocol voor de methodologische aanpak met een verbeterde spatiotemporele resolutie van 0,4 ms en 12 nm. De verbeterde resolutie konden we voorbijgaande actief transport en passieve diffusie gebeurtenissen vast te leggen door middel van de nucleaire porie complexen (NPC) in semi-intacte cellen. We verwachten dat deze methode te gebruiken in het ontrafelen van andere bindende en-handel gebeurtenissen binnen cellen.

Protocol

1. Voorbereiding van de cel-systeem voor single molecule experimenten

1. Ten minste een week van te voren, een verse cultuur van HeLa cellijn starten vanuit een voorraad van ontdooien bij 37 ° C en de invoering van een 25 cm ² cultuur kolf met 5 ml media, Incubeer de cellen bij 37 ° C binnen 5% CO ₂ incubator voor 24 uur en splitsen minstens 3 keer om een ​​optimale conditie voor de cellen. Maar de cellen mogen niet worden gesplitst meer dan 20 keer te wijten aan neiging van hun groei aanzienlijk vertragen. HeLa cellen werden eerder genetisch gemanipuleerd om GFP (groen fluorescerend eiwit) gefuseerd aan het nucleaire envelop porie membraaneiwit POM 121 hebben. Het is noodzakelijk voor een precieze lokalisatie van de nucleaire envelop.
2. Een dag voor het experiment, moeten cellen bestemd voor een enkel molecuul experiment worden verspreid op een geautoclaveerd dekglas in een steriele petrischaal. Het dekglaasje moet worden opgeschort in DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, Grand Island, NY), aangevuld met 4,5 g / L glucose, 862 mg / L Glutamax-I, 15 mg / ml fenol rood, 100 U / ml penicilline, 100μg/mL streptomycine en 10% pasgeboren kalf serum. Het volume van een cultuur moet worden 1 ml per dekglas, gelijkmatig verspreid over het oppervlak. Deze petrischalen met de dekglaasjes worden dan geplaatst in de CO _2-incubator en gedurende 24 uur voorafgaand aan het experiment. Om een ​​cel cultuur geschikt zijn voor een enkel molecuul experiment de cel confluentie op de cover slip mag niet meer dan 70% om een ​​goede vrijheid voor wassen buffers en eiwitten van belang het ondergaan van de nucleaire vervoer aan te bieden.
3. Op de dag van het experiment werden flow-kamers gebouwd door het toevoegen van een deksel samen slip met twee lijnen van siliconenvet als afstandhouders. Het is essentieel om te zorgen dat de cellen niet uitdrogen tijdens de voorbereiding. We meestal de voorkeur aan hebben twee kamers gemaakt op een dekglas om twee verschillende omstandigheden het toelaten voor het experiment. De top dekglaasjes kleine reepjes van glas dekglas gesneden met een diamant mes op ongeveer 6mm2 werden ondersteboven geplaatst op een Kimwipe. Twee lijnen van siliconenvet werden fijn geplaatst langs hij randen van de dekglaasjes met een 10 ml plastic spuit die een pipettip stevig bevestigd met Parafilm om de grootte van het vet kraal controle had.
4. De HeLa-cel gecoate glijbaan was daarna druppelen gedroogd en gemonteerd met vet als lijm in een home-bewerkte aluminium frame - humeur, die diende om de dia in de microscoop monsterhouder te houden.
5. De top dekglaasjes met de twee lijnen van vet werden vervolgens opgepikt met een puntige pincet en dan omgekeerd op de cel-gecoate glijbaan, de vorming van een stromingskamer. Een relatief sterke gehechtheid werd gemaakt door te drukken voorzichtig over de ingevette randen van het dekglaasje.
6. Aangezien wij twee aparte kamers gemaakt op een cel-gecoate schuif is het essentieel om een ​​goede afdichting om kruisbesmetting te voorkomen. Voor dit doel een aantal lijnen van het siliconenvet werden toegepast in tussen de kamers van de top naar de bodem van de dia om het uit elkaar verzegelen. Verscheidene lijnen van vet waren ook op de buitenkant van de kamers.
7. DMEM medium werd vervolgens toegevoegd aan de stroom kamer om de cellen te voorkomen dat uitdroogt. Oplossing doorstroming werd bevorderd door een klein stukje filtreerpapier om de vloeistof te absorberen uit de uitgang kant van de stroom kamers. Met vaste hand, zou oplossing tegelijkertijd worden toegevoegd door micropipet aan een kant van de flow-kamer met een hand, en geabsorbeerd aan de andere kant door filtreerpapier.
8. Na de bouw, was de onderkant van de schuif gewassen met een natte wattenstaafje, twee keer met water en vervolgens tweemaal met 100% ethanol.
9. Zodra de slide is gemonteerd op de microscoop, de cellen gewassen met 2 X 25 uL import-buffer (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). De cellen vervolgens gepermeabiliseerde voor ~ 2 minuten met 2 X 25 pl 40 ug / ml digitonine in import buffer en gewassen opnieuw met 2 X 25 uL import-buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) aangevuld met 1,5% polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 kDa). Het kan nodig zijn om de permeabilisatie in een real time via de helder veld monitor. PVP is opgenomen in alle import bufferoplossingen na digitonine tot osmotische zwelling van kernen te voorkomen. De intacte kern, samen met een gecontroleerde cytoplasmatisch omgeving, zorgt voor een sterk vereenvoudigd transport-systeem dat ons in staat stelt te verhelderen de ingewikkelde nucleaire transport stap voor stap. Vorige ensemble en single-molecule experimenten die uitgevoerd in het systeem hebben grote inzichten in de nucleaire transport.

2. De voorbereiding van essentiële eiwitten voor nucleaire transport experiment

1. Door middel van een conventionele bacteriële transformatie van de speciale stammen van E. coli (JM109) werden ontworpen om de genen die verantwoordelijk zijn voor de overexpressiede productie van de bovengenoemde eiwitten van belang en worden op voorraad gehouden bij -80 ° C. (Voor de NLS-2xGFP gebruikten we pTrcHisB vector door Invitrogen). Een entoog met bacterie of ~ 50 ul van bevroren voorraden van fluorescerende eiwitten tot expressie of lading E. Coli cellen worden overgebracht naar 5 ml LB medium met toevoeging van 5μL van ampicilline (U 1000) en aëroob gegroeid met schudden 's nachts bij 37 ° C bij 225 rpm.
2. Na 24 uur 500 pi van verzadigde cultuur wordt overgebracht in 500 ml LB media en geschud in de 37 ° C incubator voor 5-6 uur na de toevoeging van 250 pi IPTG (isopropyl _-D-1-thiogalactopyranoside) en geïncubeerd voor een ander 5-6 uur. Het is nodig omdat IPTG is een lactose metaboliet die triggers transcriptie van het lac operon, waar het lacZ-gen vervangen wordt door het gen van interesse en IPTG wordt vervolgens gebruikt om genexpressie te induceren.
3. De cultuur wordt vervolgens gesponnen in de koeling hoge snelheid centrifuge bij 12000 rpm gedurende 15 minuten en het supernatant wordt weggegooid. Cellen worden dan opnieuw gesuspendeerd in 40 ml CelLytic B (CelLytic B resulteert in een snelle en efficiënte winning van eiwitten die geschikt zijn voor affiniteit zuivering en analyse.) Het volume moet worden gebaseerd op 10 ml per 1 gram van een pellet. 28 ui van mercapto-ethanol wordt toegevoegd aan disulfidebindingen en 400 ul van phenylmethanesulphonyl fluoride te breken proteasen deactiveren vanaf het verteren van eiwitten van belang na cellysis. Een "protease cocktail" is ook toegevoegd (400 pi van 0,2 mg / ml pepstatine A. 400 pi van 0,2 mg / ml leupeptin, 400 pl van 2 mg / ml trypsine-remmer) om ervoor te zorgen dat de proteïne-extracten niet voor de analyse af te breken voor doelen van belang. Vervolgens hebben we 400 pi 1M imidazol toe te voegen, wordt gebruikt om de gemerkte eiwitten gebonden aan Ni-ionen aan het oppervlak van de parels in de chromatografie kolom en 1 mM van DNase I, gebruikt om ongewenste single-en double-stranded DNA af te breken in 5 phosphodinucleotide en oligonucleotide elueren fragmenten.
4. Roer het mengsel in het donker op ijs gedurende 30 minuten tot een voldoende tijd voor de reactie, spin staat op 10000 rpm gedurende 60 minuten in de koeling centrifuge. Oogst de supernatant en ter voorbereiding van chromatografie uitvoeren van de infusie met Ni-NTA (nikkel-nitrilotriazijnzuur Superflow door Qiagen) door het draaien in microfuge centrifugebuis bij max. snelheid voor 3 minuten en wassen met lysisbuffer, herhalen van spinnen en wassen tot het mengsel is uit de buurt van een blauwe tint. Roer het resulterende mengsel langzaam in een donkere container op ijs gedurende 60 minuten.
5. Voer de kolomchromatografie die door 12 fracties als volgt. De eerste fractie is een doorstroming van 10 ml supernatant gemengd met Ni-NTA in de vorige stap. De tweede is 10 ml lysis buffer (50 mM Na-fosfaat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0), de derde 10 ml buffer (10 mM imidazool, 100 mM NaCl, pH 8,0), de vierde en de rest zijn 0,5 ml elutie buffer (250 mM imidazool, 100 mM NaCl, pH 8,0)
6. De voorbereiding van de SDS-PAGE polyacrylamide gel en bereiden onze monsters door het mengen van 4 pi van een fractie en een pi van 5x SB (300mm Tris 6.8, 25% BME, 10% SDS, 50% glycerol). Voor de standaard gebruikten we 100 kb DNA-ladder door Invitrogen. Voor het laden we onze samples 5 minuten gekookt. Na het laden we liepen de gel bij 120V gedurende 60 minuten. Dan gaan we gekleurd, ontkleurd en tenslotte gedroogd in een speciale gel droger gedurende 2 uur bij 80C.
7. Vervolgens hebben we bekeken de resultaten op de gel en zich de fracties die het beste resultaat opgeleverd. Afhankelijk van het eiwit van onze interesse, moeten de banden respectievelijk gelegen aan de grootte van een eiwit. Deze fractie moet worden geselecteerd voor verdere eiwitzuivering met MonoQ en Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. Concentratie is uitgevoerd door het draaien van de meest geconcentreerde fracties in Nanosep filter met een poriegrootte van 10K bij 14 rpm gedurende 5 minuten, te wassen met elutiebuffer elke keer. Het is noodzakelijk om de uiteindelijke eiwitconcentratie gebruik maakt van de BSA-test voor een verdere eiwit labeling procedure te bepalen.
9. De intrinsieke groene fluorescentie van NLS-2xGFP kunnen niet worden gebruikt voor single molecule beeldvorming van nucleair transport als gevolg van de slechte foto-stabiliteit en overlapt spectrum met cel autofluorescentie. Zo hebben we het etiket de lading moleculen met een overmaat van een cysteïne-reactieve organische kleurstof (Alexa555 of Alexa 647 maleïmide van Molecular Probes) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in 50 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl na te verminderen met TCEP tris (2 - carboxyethyl) gedurende 20 minuten. Reacties waren afgeschrikt met 2-mercaptoethanol, en het eiwit oplossingen werden gedialyseerd de vrije kleurstof te verwijderen.

3. Enkel molecuul microscopie

1. Onze microscoop set bestaat uit een Olympus IX81 uitgerust met een 1.4 NA 100x olie-immersie objectief (UPLSAPO 100XO, Olympus), een 35 mW 633 nm He-Ne laser (Melles Griot), een kwik lamp met GFP-filter ingesteld, een op -chip vermenigvuldiging gain charge-coupled device camera (Cascade 128 +, Roper Scientific) en the Slidebook software pakket (Intelligent Imaging Innovations) voor data-acquisitie en-verwerking. Een optische chopper (Newport) werd gebruikt om een ​​on-off-stand van laser excitatie te genereren. GFP en Alexa647 fluorescentie werd opgewekt door een kwiklamp en 633 nm laser respectievelijk. De groene en rode fluorescentie-emissie werd verzameld door hetzelfde doel, gefilterd door een dichroïsche filter (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) en een emissie-filter (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) en afgebeeld door een identieke CCD camera.
2. In single molecule experimenten, we kunnen de fluorescentie fotobleken tijd van de single lading molecuul langer dan transport tijd. Voor het bepalen van het photobleaching tijd, zijn 0,1 nM lading moleculen uitgeplaat op een glazen afdekplaat slip en worden immobiel na 30 minuten, vanwege niet-specifieke absorptie. Vervolgens wordt het tijdsverloop van de fluorescentie gemeten. Afhankelijk van het eiwit van belang photobleach keer anders zal zijn gebaseerd op het aantal van cysteins in staat om te reageren met maleïmiden, daarom is de lichtintensiteit en de verlichting gebied moet worden aangepast om niet leiden tot een voorlopige photobleaching en te verzekeren dat de lading moleculen gelabeld met Alexa 647 weer te geven fluorescentie langer dan de ladingen interactie met NPC's.
3. Voor invoer experimenten in gepermeabiliseerde cellen, werden de lading en essentiële co-factoren transport bij elkaar opgeteld. Typische import lading reacties bevatte 1 mM GTP, 0,5 uM Importin-, 0,5 uM Importin-1, 2 uM Ran en 1 uM NTF2 voor vergemakkelijkt het transport en 0,1 nM van 10KDa Dextraan voor passieve transport .. Fluorescerende lading concentraties waren> 100 nM in bulk experimenten, en ~ 100 uur voor single molecule assays. Bij deze concentraties, was> 99% van de lading zal naar verwachting complexen met Importin en Importin vorm. Vervoer bedroeg gecontroleerd door epifluorescentie (al was het maar ten opzichte van de tarieven van belang waren) of confocale fluorescentie microscopie (als absolute cijfers waren gewenst).
4. Eerst wordt de positie van de nucleaire envelop werd bepaald door de wide-field epifluorescentie microscopie door het aantrekken van een HBO-kwiklamp met een set van GFP filters om een ​​beeld te krijgen van de NE te nemen. De pixel intensiteiten in een rij of kolom zijn ongeveer loodrecht op de NE geschikt waren met Gaussiaans vervagen. De piek posities van de Gaussian voor een bepaalde set van pixel intensiteiten werd beschouwd als de NE positie voor die rij en kolom. De piek posities van een reeks van dergelijke gaussianen werden vervolgens aansluiten bij een tweedegraads polynoom, waardoor het pad van de NE binnen de gehele afbeelding.
5. Zodra het NE is gelokaliseerd, is het essentieel om zich te ontdoen van alle autofluorescentie gebruik te maken van een 633 nm He-Ne laser tot deze volledig is photobleached, meestal meer dan 60 seconden is voldoende.
6. Monster moleculen moet vervolgens worden bewaard in een 1,5% oplossing van PVP en het mengsel toegevoegd om de stroom kamer in een volume van 25 L en dan gesleept door de kamer het toepassen van een pit van filtreerpapier. Een volslagen zorg moet worden genomen op de toevoeging van de import lading eiwitten om de gepermeabiliseerde cellen direct na de nucleaire envelop lokalisatie, omdat de focus kan gemakkelijk worden verstoord door een heftige beweging.
7. Zodra de lading moleculen worden toegevoegd, 633 nm He-Ne laser werd gebruikt om het transport van de trajecten doorgevoerd moleculen te verlichten. Een optische chopper (Newport) moeten worden betrokken bij ongeveer 5 Hz tot de photobleaching te wijten aan een hoge vermogensdichtheid van de laser, maar ook om een ​​nieuw deel van de niet-photobleached enkele moleculen aan de NE benadering te vermijden. Een serie video's van single molecule translocaties moeten worden genomen met een high-speed CCD-camera die kan oplopen tot 2500 Hz.

4. Representatieve resultaten

Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om een ​​reeks video's aantonen van de translocatie van een enkele lading moleculen interactie met de nucleaire porie complex in gepermeabiliseerde HeLa POM 121 cellen te verzamelen. (Fig 1). We stellen om beeld en volgen de voorbijgaande vervoer stappen van dextran moleculen door de NPC in digitonine-gepermeabiliseerde HeLa cellen die stabiel tot expressie GFP-POM121. Cellen werden geïncubeerd met lage concentraties van de gelabelde moleculen dextran. Het equatoriale vlak van de kern werd naar voren gebracht, met een duidelijk beeld van de groene ring van de GFP fluorescentie opgewekt door een 488-nm kwiklamp licht. Een lange-time blootstelling van GFP-NE stelt ons in staat om een ​​uitstekende signaal-ruisverhouding (SNR) ratio te verkrijgen te lokaliseren het midden vlak van de NE. Voorheen 10 kDa dextran moleculen werden gevonden om door het NE diffuse binnen ongeveer 2 ms met een ruimtelijke resolutie van ongeveer 20-40 nm door een detectie-frame rate van 500 of 1000 Hz. Zo'n tijdruimtelijke resolutie laat vangen van slechts een tot twee diffusie stappen van dextran moleculen door de NPC, die niet voldoende is om meer ruimtelijke informatie voor de passieve diffusie toe te lichten. Om meer kleine stapjes van dextran moleculen te vangen binnen het NPC met een betere spatiotemporal resolutie, hebben we twee belangrijke verbeteringen uitgevoerd: (i) om een ​​snellere detectie frame rate van 2500 Hz aan te passen aan meer fijne diffusie stappen vast te leggen, en (ii) naar een hoger verlichting optische dichtheid te gebruiken om meer fotonen te wekken van enkele moleculen te verkrijgen een hogere ruimtelijke resolutie. Deze verbeteringen stellen ons in staat om meerdere stappen van voorbijgaande verspreiding van alexa647-gelabeld dextran moleculen vast te leggen over de NE door een 633-nm laser licht aan instraling van 100 kW / cm ² met een tijd-ruimtelijke resolutie van 12 nm en 400 ms.

Zoals weergegeven in figuur 1, werden een reeks stilstaande beelden van typische transport gebeurtenissen van dextran moleculen opgenomen. Door het volgen van de ruimtelijke trajecten van individuele doorgevoerd dextran moleculen, werden de kleine stapjes van diffusie door de NE onderscheiden. Wij vonden dat er ongeveer 30% van interactie evenementen met de NE hebben erkend oorsprong en bestemming compartimenten. Onder hen, dextran moleculen verplaatsen van het cytoplasma naar de NE hebben twee bestemmingen: einde in de kern na diffunderen door het NE of terug te gaan naar het cytoplasma na interactie met de NE De vergelijkbare situaties zich voor de export evenementen: dextran moleculen vanuit de kern voer het cytoplasma of diffuse terug naar de kern na interactie met de NE. Een dergelijke afbeelding serie bevatten informatie over de ruimtelijke positie van de individuele moleculen met betrekking tot de NPC, evenals temporele informatie over de verblijftijd van de moleculen door de NPC. Door het analyseren van de trajecten van dextran moleculen rond het gebied van NE, kan de reistijd, de efficiëntie en de entree frequentie worden bepaald. Het transport tijd in ons werk kunnen worden geïdentificeerd als de import of de uitvoer tijd. Ze werden gedefinieerd als de gemiddelde tijd van dextran moleculen wonen binnen de NPC's die de invoer of uitvoer te ondergaan. De invoer of uitvoer efficiëntie werd gedefinieerd als het percentage van de volledige invoer of de uitvoer gebeurtenissen van de som van de volledige en mislukte evenementen. De invoer of uitvoer ingang frequentie verwijst het aantal moleculen interactie met de NE tijdens een tweede.

Figuur 1. Geselecteerde video frames van typische transport gebeurtenissen van dextran moleculen door het NE. (A) Een cytoplasma-to-kern evenement. Een enkele dextran molecuul (rode stip), gestart vanuit het cytoplasma, interactie met de NE (groene pixel lijn), en eindigde in de kern. De trajecten van het evenement (blauwe lijnen en open punten) werden bepaald en gelegd met de NE (zwarte lijn). De groene en rode lijnen stellen 100 nm-afstand van het NO op het cytoplasma en de nucleaire kant. C, het cytoplasma. N, de kern. Schaalbalk: 2 mm. (B) Een cytoplasma-to-cytoplasma evenement. (C) A kern-to-kern evenement. (D) een kern-to-cytoplasma evenement.

Discussion

Zorg moet worden genomen om een ​​goede colocalization van NE en enkele moleculen te verzekeren tijdens het experiment. Het is ook belangrijk te zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding, vooral wanneer het signaal laag is als gevolg van slechte etikettering of fotobleken. Lokalisatie precisie wordt beperkt door de ruis (als gevolg van out-of-focus fluorescentie, CCD uitlezing lawaai, donkere huidige en andere factoren).