원자력 교통 단일 분자 이미징

Summary

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

Abstract

단일 분자 형광 현미경 접근의 유틸리티는 지난 10 년간 생물 학적 반응을 이해하는데 큰 소용이 될 입증되었습니다. 세포 내에서 깊은 높은 시간적 및 공간적 해상도로 분자 상호 작용의 조사로 인해 각각의 분자에서 발생하는 본질적으로 약한 신호에 도전 남아있다. 양 외가 최근 작동합니다. 좁은 - 현장 epifluorescence 현미경은 단일 분자 수준에서 nucleocytoplasmic 운송 시각화를 허용 보여주었다. 신호 의존과 독립화물 분자의 단일 분자 접근법 등 핵 수송 시간과 효율 중요한 운동에 의해 얻은되었습니다. 여기 우리는 0.4 MS 12 NM의 향상 spatiotemporal 해상도와 방법론의 접근 방식에 프로토콜을 설명했다. 향상된 해상도는 우리 반 그대로 세포의 핵 기공 단지 (NPC)를 통해 과도 적극적인 전송 및 수동 확산 이벤트를 캡처 수있었습니다. 이 방법은 세포 내의 다른 바인딩과 인신 매매 사건을 elucidating에 사용될 예정입니다.

Protocol

1. 단일 분자 실험의 셀룰라 시스템의 준비

1. 사전에 적어도 하나의 주, 37 ° C를 해동 5 ML 미디어 25cm ^두 문화 플라스크에 넣어 주식에서 헬라 세포 라인의 새로운 문화를 시작, 37에서 세포를 품어 ° C 이내에 5 % CO ₂ 24 시간 보육 및 세포에 대한 최적의 조건을 제공하기 위해 최소한 3 번 나눠. 그러나 세포는 크게 천천히 자신의 성장 속도 proclivity으로 인해 20 개 이상의 시간을 분할해서는 안됩니다. 헬라 세포는 이전에 다음 ID로 유전자 핵 봉투 기공 막 단백질 POM 121에 융합 GFP를 (녹색 형광 단백질)하도록 설계되었습니다. 그것은 핵 봉투의 정확한 현지화 필요합니다.
2. 하루 전에 실험, 단일 분자 실험을위한 세포는 멸균 페트리 접시에 배치 autoclaved 커버 슬립에 전파해야합니다. coverslip는 4.5 g / L의 포도당, 862 MG / L GlutaMAX - I, 15 MG / ML 페놀 레드, 100 U / ML 페니실린, 100μg/mL와 보충 DMEM (Dulbecco의 수정 이글 배지, 그랜드 아일랜드, NY)에서 일시 중지되어야합니다 스트렙토 마이신와 10 %의 신생아 송아지 혈청. 문화의 볼륨 균일하게 표면 전체를 통해 분산 커버 슬립 당 ​​1mL,해야합니다. 커버 풀렸는데 이러한 배양 접시는 다음 CO ₂ 배양기에 배치 사전 실험에 24 시간 동안 보관됩니다. 단일 분자 실험에 적합하기 위해 세포 배양하기 위해서 커버 슬립에 confluency 세포는 핵 수송을받은 관심 세척 버퍼 및 단백질에 대한 좋은 자유를 제공하는 70 %를 넘지 않아야합니다.
3. 실험의 날, 흐름 챔버 스는 최고의 커버 스페이서로 실리콘 기름의 두 라인과 함께 미끄럼 추가하여 건설되었다. 이것은 세포가 준비하는 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 필수적입니다. 우리는 보통 표지에 만든 두 챔버 스가 실험을 위해 두 개의 서로 다른 조건을 허용하도록 살짝해야하는 것을 선호합니다. 상단 커버는 약 6mm2가 Kimwipe에 거꾸로 놓여 있었다 될 수있는 다이아몬드 칼로 절단 유리 커버 슬립의 작은 조각 버렸는데. 실리콘 그리스의 두 라인은 잘게 단단히 그리스 비드의 크기를 제어하는​​ Parafilm와 연결된 피펫 팁을했다 10 ML의 플라스틱 주사기로 커버 전표의 그 가장자리를 따라 배치되었다.
4. 헬라 세포 코팅 슬라이드 다음 드립 건조 및 가정 가공 알루미늄 프레임에 접착제로 그리스와 함께 탑재했습니다 - 성격, 현미경 샘플 홀더에 슬라이드를 개최 하였다.
5. 그리스의 두 라인 상단 커버 전표는 다음 흐름 챔버를 형성, 세포 - 코팅 슬라이드를 통해 거꾸로 지적 핀셋 그리고 함께 체포되었다. 상대적으로 회사 첨부 파일이 coverslip의 기름칠 가장자리를 통해 부드럽게 눌러 만들어졌다.
6. 우리가 한 셀 - 코팅 슬라이드에 두 개의 별도의 방을 만들므로 그것은 교차 오염을 방지하기 위해 좋은 씰링을 제공하는 것이 필수적입니다. 이러한 목적으로 실리콘 그리스의 여러 라인이 떨어져 인감 가기에서 슬라이드의 하단에 실 사이에 적용되었습니다. 그리스의 여러 라인 또한 챔버의 외부 측면에 넣어했다.
7. DMEM 미디어 다음 밖으로 건조로부터 세포를 방지하기 위해 흐름 챔버에 추가되었습니다. 솔루션 흐름은 흐름 챔버의 출구 쪽의 유체를 흡수하는 작은 조각 종이 필터에 의해 추진되었다. 꾸준한 손으로, 솔루션 micropipette하여 한 손으로 흐름 챔버 한쪽으로 동시에 추가할 수, 및 필터 종이로 반대편에 흡수.
8. 건설 후, 슬라이드의 아래쪽은 두 번 물로, 침수 솜 밀고 면봉로 씻은 다음 두 번 100 % 에탄올로.했습니다
9. 슬라이드가 현미경에 장착되면, 세포는 2 X 25 μL 수입 버퍼 (20 MM의 Hepes, 110 MM KOAc, 5 MM NaOAc, 2 MM MgOAc, 1 MM EGTA, 산도 7.3)로 세탁. 세포가 수입 버퍼 2 X 25 μL 40 μg / ML digitonin와 ~ 2 분 동안 permeabilized 2 X 25 μL 수입 버퍼 (20 MM의 HEPES, 110 MM KOAc, 5 MM NaOAc, 2 MM MgOAc, 1 ㎜로 다시 세탁 360 KDA), EGTA, 산도 7.3) 1.5 % polyvinylpyrrolidone (PVP와 함께 보충. 그것은 밝은 필드를 사용하여 실시간으로 permeabilization을 모니터 할 수 있습니다. 핵의 삼투 팽창을 방지하기 위해 digitonin 후 PVP는 모든 수입 버퍼 솔루션에 포함되었습니다. 함께 제어 세포질 환경에 그대로 핵은, 우리는 단계로 복잡한 핵 수송 단계를 명료하게하다 수 있도록 크게 단순화된 교통 시스템을 제공합니다. 시스템의 실시 이전 앙상블과 단일 분자 실험은 핵​​ 수송 큰 통찰력을 제공하고 있습니다.

2. 핵 전송 실험에 필수적인 단백질의 준비

1. 일반 세균 변화를 통해 E.coli (JM109)의 특별한 변종은에 책임이있는 유전자를 overexpress 수 있도록 설계되었습니다관심 상기 단백질의 생산하며 -80 ° C.에 재고가 유지됩니다 (NLS - 2xGFP 위해 우리는 Invitrogen로 pTrcHisB 벡터를 사용). E. 대장균 세포를 표현하는 형광등이나화물 단백질의 냉동 주식 loopful 또는 ~ 50 μL는 암피실린의 5μL를 추가로 LB 미디어의 5mL로 전송 (U 1000) 37에서 야간 흔들어 ° C를 225 rpm으로 함께 aerobically 성장하고 있습니다.
2. 24 시간 후에 포화 문화 500 μL는 LB 미디어 500 ML에 전송되고 37 ° C 배양기에서 떨면서 5-6시간 250 μL IPTG의 추가 (이소 프로필 _ - D - 1 - thiogalactopyranoside) 다음과 같은 다른에 대한 incubated 5~6시간. IPTG는 lacZ 유전자가 관심과 IPTG의 유전자로 대체됩니다 락 오페론의 전사가 다음 유전자 발현을 유도하는 데 사용되는 트리거되는 유당 대사이기 때문에 그것이 필요합니다.
3. 문화 다음 15 분 동안 12,000 rpm으로 냉각 고속 원심 분리기에 걸려든되고 뜨는가 삭제됩니다. 전지는 그 볼륨이 펠렛의 1g 당 10 ML을 기반으로해야합니다 CelLytic B (친화력 정화 및 분석에 적합 단백질의 신속하고 효율적인 추출에 CelLytic B 결과.) 40 ML에 resuspended 있습니다. 메르 캅 토 에탄올 28 μl는 세포 용해 후 관심 단백질 소화의 프로 테아제를 비활성화 이황화 채권 phenylmethanesulphonyl 불화 400 μl을 깰에 추가됩니다. 단백질 추출물은 대상에 대한 분석을하기 전에 저하하지 않도록하기 위해서는, "프로 테아제의 칵테일"도 (2 MG / ML 트립신 억제제 400 μL 0.2 MG / ML 류펩틴의 0.2 MG / ML pepstatin A. 400 μL 400 μL)이 추가됩니다 관심. 우리는 다음 400 μL 1M 졸을 추가, 5 phosphodinucleotide 및 oligonucleotide로 원치 않는 단일 및 이중 좌초된 DNA를 저하하는 데 사용 DNase I의 크로마 토그래피 컬럼 및 1mM의 구슬의 표면에 부착된 니켈 이온에 바운드 태그 단백질을 elute하는 데 사용됩니다 조각.
4. 냉각 원심 분리기에서 60 분 10,000 RPM의 반응에 대한 적절한 시간, 스핀을 허용하는 30 분간 얼음 어둠 속에서 혼합물을 저어. 뜨는을 수확하고 크로마 토그래피에 대비하여 3 분 최대 속도 microfuge의 원심 분리기 튜브의 회전 및 용해 버퍼로 세척, 혼합물이 될 때까지 회전 및 세탁을 반복하여 니켈 NTA (Qiagen의 니켈 - nitrilotriacetic 산성 Superflow)으로 주입을 수행 모든 푸른 색조의 취소합니다. 천천히 60 분 정도 얼음에 어두운 용기에 표시된 혼합물을 저어.
5. 칼럼 크로마 토그래피는 다음과 같이 12 분수 흐르는 수행합니다. 첫 번째 소수는 이전 단계에서 니켈 - NTA로 혼합 10 ML의 뜨는의를 통해 흐름입니다. 두 번째는 용해 완충액 10 ML (50 MM 나 - 인산, 300 MM NaCl, 20 MM 이미다졸, 산도 8.0)이며, 셋째 열 버퍼의 ML (10 MM 이미다졸, 100 MM NaCl, 산도 8.0), 넷째 나머지입니다 용출 버퍼의 0.5 ML (250 MM 이미다졸, 100 MM NaCl, 산도 8.0)
6. SDS - PAGE의 polyacrylamide 젤을 준비하고 분수 4 μL와 배 SB (300mM 트리스 6.8, 25 % BME 10 % SDS, 50 % 글리세롤) 1 μL를 혼합하여 샘플을 준비합니다. 표준 우리는 Invitrogen 100 이하의 DNA 사다리를 사용했습니다. 로드하기 전에 우리가 5 분 동안 우리의 샘플을 삶아. 로딩 후에 우리가 60 분 동안 120V에서 젤을 실행. 그렇다면, 스테인드 destained 그리고 마지막으로 80C에서 2 시간 동안 특수 젤 건조기에서 건조.
7. 우리는 다음 겔에서 결과를 조회하고 최상의 결과를 굴복 분수를 위치하고 있습니다. 우리의 관심의 단백질에 따라 밴드는 단백질의 크기에 각각 위치한다. 이 분수는 MonoQ 및 Superdex 200 (애머스햄 Pharmacia)을 추가로 단백질 정화를 위해 선택되어야합니다.
8. 농도는 모든 시간을 5 분 14 RPM에서 10K의 기공 크기 Nanosep 필터에서 가장 집중적으로 분수를 회전 용출 버퍼로 세척하여 수행됩니다. 그것은 더 이상 단백질 라벨 절차에 대한 BSA 분석을 이용하여 최종 단백질 농도를 결정하는 것이 필요합니다.
9. NLS - 2xGFP의 본질 녹색 형광은 그 사진 안정성 가난하고 overlapped 스펙트럼 세포 autofluorescence로 인해 핵 교통 단일 분자 이미징을위한 이용하실 수 없습니다. 따라서, 우리는 TCEP 트리스 (2 감소 후 50 MM의 인산 나트륨, NaCl 150 MM의 실온에서 2 시간 시스테인 반응 유기 염료 (분자 프로브에서 Alexa555 또는 알렉사 647 maleimide)의 초과와화물 분자를 라벨 - 20 분 carboxyethyl). 반응은 2 - 메르 캅 토 에탄올과 침묵되었고, 단백질 솔루션은 무료 염료를 제거하는 dialyzed했다.

3. 단일 분자 현미경

1. 우리 현미경 세트는 최대 1.4 NA 100x 기름 침지 목표 (UPLSAPO 100XO, 올림푸스)을 갖춘 올림푸스 IX81, 35 MW 633 nm의 GFP 필터와 수은 램프가 설정 He - Ne 레이저 (Melles Griot),에 포함되어 있습니다 칩 증 이득 전하 결합 소자 카메라 (캐스케이드 128 +, 로퍼 과학)와 일데이터 수집 및 처리를 위해 전자 Slidebook 소프트웨어 패키지 (지능형 이미징 혁신). 광학 초퍼 (뉴 포트)은 레이저 여기의 온 - 오프 모드를 생성하는 데 사용되었다. GFP 및 Alexa647 형광는 각각 수은 램프와 633 nm의 레이저에 의해 흥분했다. 녹색과 빨간색 형광 방출은 이색성 필터 (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) 및 배출 필터 (NF01-405/488/561/635-25X5에 의해 필터링 같은 목적에 의해 수집되었다. 0 Semrock)과 동일한 CCD 카메라에 의해 몇 군데.
2. 단일 분자 실험에서 우리는 수송 시간 이상으로 단일화물 분자의 형광 photobleaching 시간을 설정합니다. photobleaching 시간을 확인하려면, 0.1 NM화물 분자가 아닌 특정 흡수로 인해 30 분 후에 슬립과 고정되어되는 유리 커버에 도금입니다. 그런 다음, 형광의 시간 과정은 측정됩니다. 관심 photobleach 시간의 단백질에 따라 그러므로 maleimides, 조도 및 조명 면적 반응하는 능력을 cysteins의 숫자에 따라 달라집니다 예비 photobleaching를 유도하지 순서대로 조정할 수 있어야하며 알렉사 647 디스플레이 표시되는화물 분자를 확보 cargos가 NPCs와 상호 작용 이상에 대한 형광.
3. permeabilized 세포의 수입 실험은화물과 필수적인 교통 cofactors 함께 추가되었습니다. 일반 수입화물 반응이 1 ㎜ GTP, 0.5 μm의 포함된 Importin을, 0.5 μm의 Importin - 1, 2 μm의 달아 및 수동 전송 10KDa Dextran의 촉진 수송 및 0.1 nm의 1 μm의 NTF2 .. 형광등화물 농도가 대량 실험에서> 100 nm의되었고, 단일 분자 assays 100 오후 ~. 이 농도에서화물의> 99%는 Importin와 Importin과 단지를 형성 것으로 예상했다. 전송 속도는 epifluorescence (단 상대 속도가 중요하게 여긴다면) 또는 공촛점 형광 현미경 (절대 속도를 원하는이라면)에 의해 감시되었다.
4. 먼저 핵 봉투의 위치는 NE의 사진을 찍을하기 위해 GFP 필터의 집합과 HBO 수은 램프를 매력으로 넓은 필드 epifluorescence 현미경에 의해 결정되었다. 행 또는 열 내에있는 픽셀 농도는 대략 직각 NE에 아르 가우스와 맞는 지. 픽셀 농도의 특정 집합에 대한 가우스의 최고 순위는 해당 행 및 열에 대한 NE 위치 여겨졌다. 이러한 Gaussians 일련의 정상 위치는 다음 전체 이미지 내에서 NE의 경로를 항복, 2 급 다항식과 맞는 지.
5. NE가 현지되면 완전히 photobleached 때까지, 그것이 633 nm의 그 - NE 레이저를 사용하는 모든 autofluorescence 제거하는 것이 필수적입니다, 보통 이상의 60 초 충분합니다.
6. 샘플 분자 다음 PVP의 1.5 % 용액에 보관해야하며 혼합 25 L의 볼륨 흐름 챔버에 추가하고 필터 종이 심지를 적용 챔버를 통해 끌려. 포커스가 쉽게 어떤 격렬한 운동에 의해 중단될 수 수 있기 때문에 완전한 치료는 바로 핵 봉투 지방화 후 permeabilized 세포에 수입화물 단백질 이외에 주의해야한다.
7. 즉시화물 분자는 He - Ne 레이저는 진입중 분자의 수송 궤도를 조명하는 데 사용된 633 나노미터를 추가로. 광학 초퍼 (뉴 포트)은 고전력 레이저의 밀도뿐만 아니라 비 photobleached 단일 분자의 새로운 부분은 NE 접근 수 있도록하는 photobleaching 인해를 피하기 위해 약 5 Hz에서에 참여해야합니다. 단일 분자 translocations의 비디오 시리즈는 2,500 Hz에서 최대 갈 수있는 고속 CCD 카메라로 찍은한다.

4. 대표 결과

제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 permeabilized 헬라 POM 121 세포에서 핵 기공 복합과 상호 작용하는 하나의화물 분자의 translocation을 보여주는 동영상 일련의를 수집하는있었습니다. (그림 1). 우리는 이미지로 설정하고 안정 GFP - POM121을 표현 digitonin - permeabilized 헬라 세포에있는 NPC를 통해 dextran 분자의 과도 수송 단계를 추적할 수 있습니다. 세포는 표시 dextran 분자의 낮은 농도와 incubated했다. 핵의 적도 비행기는 488 - NM 수은 램프 라이트에 의해 흥분 GFP 형광 녹색 반지의 명확한 이미지를 초점으로 가져온 것입니다. GFP - NE의 오랜 노출은 NE의 한가운데 비행기를 집중하기 위해 우수한 신호 대 잡음 (SNR) 비율을 얻는 우리에게 있습니다. 이전 10 KDA dextran 분자 500 또는 1000 Hz의 탐지 프레임 속도로 약 20-40 나노미터의 공간 해상도를 가진 약 2 MS 내에서 NE 통해 확산을 발견했다. 이러한 spatiotemporal 해상도는 수동 확산에 대한 더 많은 공간 정보를 명료하게하다하는 것만으로는 충분하지 않습니다 NPC를 통해 dextran 분자만이 1-2 보급 단계 캡처 수 있습니다. 더 나은 spati와 NPC 사이 dextran 분자보다 좋은 단계를 캡처하려면더 잘 확산 단계를 캡처 2,500 Hz의 빠른 감지 프레임 속도를 적응 (I) 및 (2)을 구하는 하나의 분자에서 더 많은 광자를 자극 높은 조명 광학 밀도를 고용하기 : otemporal 해상도, 우리는 두 가지 주요 개선을 실시했습니다 높은 공간 해상도. 이러한 개선은 우리가 12 nm의 400 MS의 spatiotemporal 해상도 100 kW 급 / cm ² 조사량에서 633 - NM 레이저 빛으로 NE 전체 alexa647 - 표시 dextran 분자의 과도 보급의 여러 단계를 캡처할 수 있습니다.

그림 1에 표시된, dextran 분자의 전형적인 전송 사건의 스틸 이미지의 연속이 기록되었습니다. 개인 진입중 dextran 분자의 공간적 탄도를 추적함으로써, NE 통해 확산의 고급 단계는 구별되었다. 우리는 NE와 상호 작용 이벤트의 약 30 %가 발생하고 대상 구획으로 인정이있다는 것을 발견했습니다. 그 중에서도, 세포질에서 NE로 이동 dextran 분자는 두 목적지가 : NE 통해 diffusing 후 핵의 끝을하거나 유사한 상황은 수출 이벤트 발생 NE와 상호 작용 후 세포질로 이동 : 핵부터 dextran 분자 세포질을 입력하거나 NE와 상호 작용 후 핵으로 확산. 이러한 이미지 시리즈는 NPC에 관해서뿐만 아니라 NPC를 통해 분자의 면만 시간에 시간적 정보와 단일 분자의 공간적 위치에 대한 정보를 포함합니다. NE의 주변 dextran 분자의 탄도를 분석함으로써, 전송 시간, 효율성 및 입구 주파수가 결정하실 수 있습니다. 우리 연구의 운송 시간은 가져 오거나 내보내기 시간으로 확인할 수 있습니다. 그들은 평균 가져 오거나 내보내기를 받아야 NPCs 이내 dextran 분자 시간을 머물러로 정의했다. 가져 오거나 내보내기 효율성이 완료 가져 오거나 완전하고 불완전 이벤트의 합계를 통해 수출 사건의 비율로 정의했다. 가져 오거나 내보내기 입구 주파수는 두 번째 동안 NE과 상호 작용 분자의 개수를 나타냅니다.

그림 1. NE 통해 dextran 분자의 전형적인 전송 이벤트의 선택된 비디오 프레임. (A) 세포질 - 투 - 핵 이벤트. 단일 dextran 분자 (붉은 반점)은 NE (녹색 픽셀 라인)와 상호 작용, 세포질에서 시작하고, 핵에 끝났다. 이벤트 (파란색 라인 및 오픈 도트)의 궤도가 결정되고 NE (블랙 라인)로 겹쳐 있었다. 녹색과 빨간색 라인은 세포질과 핵 쪽 NE에서 100 nm의 - 거리를 나타냅니다. C, 세포질. N, 핵. 스케일 바 : 2mm. (B) 세포질 - 투 - 세포질 이벤트. (C) 핵 대 핵 이벤트. (D) 핵 - 투 - 세포질 이벤트.

Discussion

케어는 실험 도중 NE 및 단일 분자의 적절한 colocalization 확보로 이동해야합니다. 신호가 낮은 가난한 라벨 또는 photobleaching로 인해 특히 때 높은 신호 잡음 비율을 제공하는 것도 중요합니다. 현지화 정밀도는 배경 잡음 (아웃 - 오브 - 초점 형광, CCD 판독 잡음, 어두운 현재 및 기타 요인으로 인한)에 의해 제한됩니다.