Summary
Iç ve dış zarı ayırmak için bir protokol
Abstract
Francisella tularensis Gram-negatif, hücre içi coccobacillus ve zoonotik hastalık tularemi etkeni . Diğer bakteriyel patojenler, son derece düşük bulaşıcı doz (<10 CFU), hızlı hastalığın ilerlemesi, ve yüksek morbidite ve mortalite oranları Francisella öldürücü suşlar roman virülans faktörleri kodlamak öneririz ile karşılaştırıldığı zaman. Yüzey maruz kalan moleküller, yani dış membran proteinleri (OMPs), bakteri barındırmayan bağlayıcı hücre, giriş, hücre içi sağkalım, virülans ve bağışıklık kaçakçılığı teşvik etmek için ortaya konmuştur. OMPs eğitim için önemi daha da bakteriyel hastalıklara karşı koruyucu aşılar olarak hizmet gerçeğinin altını çiziyor. OMPs gram-negatif bakteriler, santrifüj ve / veya deterjan çıkarımı izledi hücrelerinin sonication dahil olmak üzere toplu membran çıkarma teknikleri aracılığıyla elde edilebilir Oysa, bu hazırlıkların çoğu periplazmik ve / veya sitoplazmik (iç) membran (IM) kirleticiler ile kontamine olmuş. Yıl boyunca, gram-negatif IM ve dış membran biyokimyasal ve biyofiziksel ayrılması için "altın standart" yöntemi (OM), sakaroz yoğunluk gradiyenti santrifüj spheroplasting ve osmotik lizis tabi bakteri olmuştur. Sukroz gradient katmanlı, OMS, batmaz yoğunlukları farklılıklar dayalı anlık mesaj ayrılmış OM lipopolisakkarid (LPS) varlığını büyük ölçüde esas olduğuna inanılan olabilir. Burada, biz, ayıklamak, zenginleştirmek ve F. izole etmek için titiz ve optimize edilmiş bir yöntem tarif tularensis dış membranlar ve bunlarla ilişkili OMPs.
Protocol
Gün 1: F. tularensis plaka aşılama
- F. Plaka dondurulmuş stok kültürleri Mueller-Hinton agara tularensis% 2.5 (hacim / hacim) donör buzağı serumu,% 2 (hacim / hacim) IsoVitaleX,% 0.1 'lik (ağırlık / hacim) glikoz ve% 0.025 (ağırlık / hacim) demir pirofosfat ile desteklenmiştir. F. büyütün 37 ° ° C'de% 5 CO 2 ile yaklaşık 24 saat tularensis
2. Gün: F. tularensis sıvı medya aşılama
- Katyon ayarlı Mueller-Hinton orta (1.23 mM kalsiyum klorür dihidrat ve 1.03 mM magnezyum klorür hekzahidrat içeren) 1 litre hazırlayın ve otoklav. 37 Ilıyınca ° C,% 0.1 'lik (ağırlık / hacim) glikoz,% 0.025 (ağırlık / hacim) demir pirofosfat ve% 2 (hacim / hacim) IsoVitaleX ile daha fazla ek orta. Iki adet 500 ml alikotları içine (0,22 μ) sterilize orta Filtresi.
- Steril 50 ml Falcon tüp içine 12 ml desteklenmiş Mueller-Hinton orta ve transfer çıkarın.
- 10-ul steril bir aşılama döngü kullanarak, F. büyük bir loopful kazımak Mueller-Hinton orta (bkz. Adım 2) 12 ml agar plakları (Gün 1) ve transfer bakteri tularensis büyüme. Pipet çözüm birden çok kez kümeleri-break up ve homojen bir bakteriyel süspansiyon hazırlamak için. Girdap değil.
- Adım 3 ila 5 ml bakteri süspansiyonu steril bir pipet kullanarak, her 500 ml damar aşılamak. 37 ° suyu kültürler büyütün ° C nazik sallayarak (New Brunswick Innova 2300 serisi çalkalayıcı 190-200 rpm) 14 ila 18 saat.
3. Gün: Spheroplasting, osmotik lizis ve sukroz yoğunluk gradiyenti santrifüj
- F. edinin tularensis sallayarak inkübatör kültürler ve ilgili optik yoğunlukları kontrol etmek için 1 ml 500 ml her kültürden bir kısım çıkarın. F. kullanırken optimum membran ekstraksiyon ve izolasyon sonuçları bulduk 0.2 - 0.4 (~ 10 7 10 8 CFU / ml) arasında bir OD 600 ile ilişkilidir büyüme, erken logaritmik faz tularensis hücreleri . Kültürler bir OD 600 0.2 'den daha az toplam sonraki sakaroz Degradeler için membran malzeme yeterli miktarda vermeyecektir. Tersine, 0.4 (sabit faz yaklaşıyor) daha OD 600 büyük kültürlerin karma membran füzyonlar verim tespit edilmiştir.
- 15 - 30 dakika için 7.500 x g kültürler Santrifüj ° C hücreleri toplamak için . Sonraki pelet süspansiyon kolaylaştırır, çünkü dört adet 250 ml santrifüj şişelerde kültürlerin santrifüj tavsiye ederiz.
- Her santrifüj şişe dikkatlice medya süpernatant kaldırmak ve sıkıca aşırı büyüme ortamı kaldırmak için emici bir malzeme şişe dokunun.
- Santrifüj 10 dakika sonra tamamlanması içinde, 8.75 ml 0.75 M sakkaroz (5 mM Tris, pH 7.5) her bakteriyel pelet askıya. Tüm dört bakteriyel pelet askıya alan ve 10 dakika içinde (bakteriyel süspansiyon toplam 35 ml) 250 ml steril bir balon (küçük stirbar) transfer edilmelidir.
- Hücre süspansiyonu yavaşça bir stirplate karıştırma sırasında, 70 ml 10 mM disodyum EDTA (2 cilt) (5 mM Tris, pH 7.8) 10 dakika boyunca yavaş yavaş ekleyin. EDTA yükseltilmiş yerel konsantrasyonlarını önlemek için hücre süspansiyonu seviyesinin altında pipet ucu ile EDTA çözeltisi ekleyin. Stirbar iyice Köpüklenmemesine veya kabarcık oluşumuna neden yeterince hızlı hücre süspansiyonu karıştırmak değil yeterli bir hızda dönen olmalıdır. EDTA çözeltisi eklendikten sonra, çözüm için 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 30 dakika inkübasyondan sonra, 11 ml (1 / 10 hacim) nihai konsantrasyonu 200 mg / ml 2 mg / ml lizozim çözüm yavaş yavaş ekleyin . Lizozim çözüm eklenmesi sırasında hücre süspansiyonu karıştırmak için devam edin. Yukarıda da belirtildiği gibi, yüksek lizozim, yerel konsantrasyonlarda önlemek için hücre süspansiyonu sıvı seviyesinin altında pipet ile lizozim çözüm ekleyin. Stok lizozim çözümleri (2 mg / ml), tek kullanımlık alikotları olarak hazırlanmış ve 3-4 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Ortaya çıkan çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- 30 dakika inkübasyon sırasında, küçük bir stirbar ve 530 ml oda sıcaklığında Cellgro Moleküler Sınıf dH 2 O (4,5 hacimleri) ile steril bir 1L şişesi hazırlayın.
- Ozmotik nazik karıştırma ile 10 ila 15 dakika boyunca Moleküler Biyoloji dH 2 O (Adım 7) 530 ml yavaş seyreltme (yaklaşık 11 ml / dak akış hızı) tarafından hücre süspansiyonu (Adım 6) lyse. Çünkü bu adımı daha geniş bir çözüm hacmi, düzgün bir karışım sağlamak için stirbar hızını artırmak. Stirbar Köpüklenmemesine veya kabarcık oluşumuna neden yeterince hızlı hücre süspansiyonu iyice dağıtmak için yeterli bir kez dH 2 O bir hızla dönen ama olmalıdır. Cel yeknesak seyreltme kolaylaştırmak için, pipet ucu stirbar bitişik balonun alt dinlenme ile hücre süspansiyonu eklel süspansiyon. Biz bu adımı sırasında 25 ml pipetler en iyi iş bulduk. Seyreltme işlemi dikkatlice izlemek ve akış hızı, hücreleri, hücre kümeleri ve hücre demetleri yerel birikimleri dağıtmak için gerekli kesme. Ortaya çıkan çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu deney genel başarı için en zorlu ve kritik bir adım olarak göründüğünü unutmayın.
- 10 az 30 dakika için 7500 xg'de 30 dakika inkübasyondan sonra, 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine 40 ml alikotları osmotik lizis çözüm transfer ° C sağlam hücreleri ve enkaz kaldırmak için.
- Santrifüj sonrasında, dikkatli bir şekilde her konik tüp ve havuz süpernatantlar süpernatant 27-30 ml steril bir 1L balonuna kaldırmak
- 200.000 2 saat, 4 x g (F50L 8x39 FiberLite ultrasantrifüjdeki rotor 44.400 rpm) ° C 16 ultrasantrifüjdeki tüpler ve santrifüj içine, her 25 ml toplanmış süpernatant transfer Her rotor 8 tüpleri tutan unutmayın, bu adımın iki rotorlar ve iki ultrasantrifüjler gerektirir. Alternatif olarak, ikinci sette 8 tüpler santrifüj ° C ye kadar 4 düzenlenen olmalıdır.
- Ultrasantrifüjdeki vadede tamamlanması 10 dakika içinde, membran tabanda tampon modifiye hazırlar. Membran süspansiyon tampon 8 ml (% 25 ağırlık / ağırlık] sakaroz, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) steril bir tüpe aktarın ve EDTA-proteaz inhibitörü kokteyl ve 375 U Benzonase 1 tablet. Proteaz inhibitörü tablet çözülür çözüm yavaşça karıştırınız.
- Ultrasantrifügasyon ardından, dikkatle, süpernatantlar kapalı dökün emici bir malzeme ultrasantrifüjdeki tüpler ters ve sıkıca fazla süpernatant kaldırmak için tüpler dokunun. Görselleştirme yardım için bir işaretleyici ile her membran pelet yerini işaretleyin. 600 ul değiştirilmiş membran tabanda tampon yavaşça sekiz membran pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Steril bir tüp nazikçe bu sekiz pelet ve havuz membran resuspensions tekrar süspansiyon, sonraki sekiz tüplerin her membran tabanda aktarın. Tüp duvar uzak peeling kadar pelet membranlar tekrar süspansiyon zor, bu yüzden, pelet üzerine değiştirilmiş membran tabanda tampon geçen devam. Genellikle tüp duvar ve yardım tabanda sürecinde kapalı zar pelet kazımak mikropipet ucu kullanmak için gerekli. Pipetleme, Köpüklenmemesine önlemek veya kabarcık oluşumu. Bu deney genel başarı için en zorlu ve kritik bir adım olarak göründüğünü unutmayın.
- Membran pelet yeniden süspanse ve 16 tüplerinden söküldükten, modifiye membran tabanda tampon 600 ul her dört tüpler yıkayın. Yıkama, her tüp (membran pelet) etrafında işaretli alana odaklı olmalıdır. Yıkama membran tabanda tüp içine aktarın. Yıkama adım dört tüpler kalan üç set tekrarlayın.
- Yün malzeme azaltılması, DNA ve yardım aşağılamak için oda sıcaklığında 30 dakika için hafif sallanan membran tabanda inkübe edin.
- Membran süspansiyon küçük bir kısım çıkarın ve toplam membran verimi belirlemek için protein kantifikasyon gerçekleştirmek. Biz genellikle sulandırılmamış hazırlamak, 1:1 (% 2.5 SDS) seyreltilmiş, 01:03 90 (% 2.5 SDS) membran örnekleri, ısı örnekleri seyreltilmiş ° C de 10 dakika ve ölçmek BioRad DC Protein Testi membran tabanda protein konsantrasyonu. Toplam protein verimi genellikle 1.0 mg / ml ve 1.6 mg / ml arasında. Isı ve SDS kullanımı, daha doğru bir protein kantifikasyon değer elde edilebilir, böylece çıkarılan membranlar OMPs serbest bırakmak için gereklidir.
- :% 55,% 50,% 45, aşağıdaki sırayla 14 x 95 mm Ultra Clear ultrasantrifüjdeki tüpler içine katman 1.8 ml sakkaroz çözümleri (ağırlık / ağırlık, 5 mM EDTA, pH 7.5) tarafından doğrusal sakaroz gradyanlar hazırlayın % 40,% 35,% 30. Sakaroz degradelerin Katmanlama bir ampul değil, otomatik bir pipet pipet kullanırken gerçekleştirmek için kolay.
- Membran proteini tabanda kantifikasyon (Adım 16), katman her degrade üstüne membran tabanda 1.5 mg geçerli. Her 14 x 95 mm ultrasantrifüjdeki tüp 10.8 ml Adım 17 sakaroz çözümleri ile muhasebeleştirilir verilen maksimum kapasitesi ve 12.5 ml, degrade başına membran tabanda 1.7 ml den fazla yük olmamalıdır. Bütün tüpler aynı kiloda (± 0,01 g), böylece her sukroz gradient tüpün son ağırlığı (membran tabanda ekleyerek veya kaldırarak) ayrı ayrı tartmak ve dikkatli bir şekilde ayarlayın.
- 256,000 en az 17 saat, 4 x g (38.000 rpm) ° C SW-40Ti sallanan bir kepçe rotor ve santrifüj Transfer sakaroz gradyanlar
4. Gün: sukroz gradient kesirler Koleksiyon
- Santrifüj 17 saat sonra, santrifüj vadede durdurmak ve SW-40Ti rotor sakaroz gradyanlar dikkatli bir şekilde kaldırın.
- % 70 etanol ile sakaroz degrade tüp alt ponksiyon dikkatlice temizleyin21g bir iğne ile tüpün alt ve steril mikrofuge'de tüpler içine degrade sıralı 500 ul kesirleri toplamak. Sonraki Degradeler için tekrarlayın. Degrade yerçekimi akışı ile damla izin verilmelidir, bu nedenle gibi sukroz gradient rahatsız etmek değil. Ancak, damlama degrade tüp alt sona ermesi halinde, küçük bir miktar baskı parmağını kullanarak tüp üst olabilir.
- Kırılma indisi refraktometre kullanılarak her sakaroz degrade fraksiyonu belirlemek ve kırılma indisi 1 g / ml belirli bir yoğunluk ile ilişkili. Nitroselüloz transfer, SDS-PAGE ayırma ve immunoblotting; temsilcisi sukroz gradient fraksiyonları (1.11 g / ml 1,26 g / ml, 0.01 yoğunluk artışlarla) hazırlarken protein yerelleştirme değerlendirin.
Temsilcisi Sonuçlar
hem Tipi IM ve OM veziküller tam ayrımını doğru yapılan bu yordamı sonuçları (örneğin SchuS4) ve B Tipi F. (örneğin LVS) suşları tularensis. Şekil 1, F. temsilcisi immunoblots gösterilen tularensis OMPs yoğunlukları arasında 1.17 ve 1.20 g / ml yerelleştirilmesine. Karşılaştırma IMPS yoğunlukları arasında 1.13 ve 1.14 g / ml yerelleştirilmesine.
Şekil 1 F., İmmünoblotting tularensis sakaroz yoğunluğu gradyanlar. Sıralı kesirler gradyanlar ve yoğunluğu (g / ml), refraktif indeksleri dayalı hesaplandı toplanmıştır. Proteinler, SDS-PAGE ile ayrılmış nitroselüloz transfer ve OMP ve IMP fraksiyonasyon algılamak için immunoblotted. mw, boyutları (kDa) her leke sol tarafında not ile molekül ağırlığı standartları prestained. F. LVS, tüm hücre lizatları tularensis LVS. Ilgili sukroz gradient fraksiyonu yoğunlukları kendi şerit yukarıda belirtilmiştir. Sol kenar boşluğu belirtildiği gibi OMPs ve IMPS, poliklonal, Monospesifik antiserumlar ile tespit edildi. F. Benzer sonuçlar elde edilmiştir tularensis SchuS4.
Discussion
Bu protokol bir spheroplasting, osmotik lizis değişimi ve sakaroz yoğunluk gradient santrifüj diğer hücre bileşenleri 2, 3, 4 fiziksel ayırma ve Gram-negatif bakteriyel OMS zenginleştirilmesi için "altın standart" açıklamaktadır. Daha önce hem Türü OMS izole etmek için bu yöntemin uygulama açıklanan Oysa F., A ve B Tipi suşları tularensis 5, bu tanıtımı OM izolasyonu için daha detaylı ve optimize edilmiş bir prosedür sunmaktadır . Gerçekten de, bu ölümcül patojen potansiyel yüzey maruz kalan ve olası virülans faktörlerinin belirlenmesi için önemli bir ilerlemedir. Bu prosedürün önemini öldürücü bir F. karşı önemli bir koruma sağladığı saflaştırılmış OMPs farelerde bağışıklama gösteren laboratuvar çalışmalarda gösterilmiştir tularensis pulmoner sorun 6. Bakteri hücreleri, osmotik lizis sırasında dikkatle izlenmesi ve membran pelet nazik tabanda Yukarıda da belirtildiği gibi, büyüme aşamasında bu membran ayırma işlemi başarı / başarısızlık ile ilişkilendirmek için kritik adımlar. Optimize edilmiş bu yöntem, titiz ve deneysel değişkenlik tabi iken, ortaya çıkan OMS deterjan kullanımı, lityum klorür, sodyum karbonat, 7, 8, 9, 10, 11 aldı, bu gibi dikkat çekecek derecede gelişmiş saflık gibi görünüyor. 12.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Hibe Numaraları NIAID / NIH P01 AI055637 ve U54 AI057156 tarafından açıklanan proje desteklenmiştir. Kitabın içeriği, sadece yazarların sorumluluğundadır ve RCE Programlar Ofisi, NIAID veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Donor calf serum | Mediatech, Inc. | 35-022-CV | |
| IsoVitaleX | BD Biosciences | 211876 | |
| Cellgro molecular grade dH2O | Mediatech, Inc. | 46-000-CM | |
| 38.5 ml polycarbonate bottle | FiberLite | 010-0514 | |
| F50L-8x39 ultracentrifuge rotor | FiberLite | 096-087051 | |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche Group | 04693132001 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 344060 | |
| SW-40Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter Inc. | 331301 | |
| Abbe benchtop refractometer | Fisher Scientific | 13-964-10 |
References
- Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).
- Nikaido, H. Isolation of outer membranes. Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).
- Mizuno, T., Kageyama, M. Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).
- Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins. J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).
- Huntley, J. F. Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis. Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).
- Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia. J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).
- Hubalek, M. Towards proteome database of Francisella tularensis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).
- Pavkova, I. Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction. Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).
- Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).
- Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein. Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).
- Twine, S. M. Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts. J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).
