Summary
Внутриутробное выживания хирургии у мышей позволяет молекулярные манипуляции экспрессии генов во время развития. Здесь мы опишем использование высокочастотных ультразвуковых для руководства инъекции ретровирусных векторов в мозг мыши в эмбриональный день (E) 9.5.
Abstract
Внутриутробное выживания хирургии у мышей позволяет молекулярные манипуляции экспрессии генов во время развития. Однако из-за стенки матки непрозрачна в период раннего эмбриогенеза, способность ориентироваться на конкретные части эмбриона для микроинъекции сильно ограничены. К счастью, высокочастотных ультразвуковых изображений позволяет генерация изображений, которые можно использовать в режиме реального времени для руководства микроинъекции иглу в эмбриональном области интереса. Здесь мы опишем использование таких изображений для руководства инъекции ретровирусных векторов в желудочковой системе переднего мозга мышей на эмбриональный день (E) 9.5. Этот метод использует лапаротомии для предоставления доступа к рогов матки, а также специально разработанные пластины, что позволяет хост эмбрионы должны быть купались в физиологическом растворе, пока они изображаются и вводят. Успешные операции часто приводят в большинстве или во всех вводят эмбрионы дожить до любого последующего момента времени интереса (embryonically или постнатально). Принципы, описанные здесь, может использоваться с небольшими изменениями для выполнения инъекций в amnionic жидкости E8.5 эмбрионов (тем самым разрешая инфекции вдоль передней задней степени нервной трубки, которая еще не закрыта), или в желудочковой системе мозга при E10.5/11.5. Кроме того, в середине нейрогенной возрастов (~ E13.5), ультразвукового изображения может использоваться непосредственный впрыск в определенные участки мозга для вирусной инфекции или клеточной трансплантации. Использование ультразвукового изображения для руководства в инъекциях внутриутробно у мышей это очень мощная техника, которая позволяет молекулярных и клеточных манипуляций эмбрионов мыши таким образом, что иначе было бы исключительно трудно, если не невозможно.
Protocol
Часть 1. Подготовка Хирургическая Площадь
- Если работа с биологически опасные реагенты (например, ретровирусные векторы), операция должна быть выполнена внутри биобезопасности II корпус (BSC). Микроскоп ультразвукового обратного рассеяния (UBM), должны сидеть рядом с BSC, с датчиком внутри BSC, и удерживается на месте с помощью двигателя контролируемой поддержку на специально созданном хирургического этапа. Компоненты, необходимые для построения стадии показано на видео, перечислены на линии. Этот список, вместе с изображениями этапе с нескольких точек зрения (по запросу), должны разрешения на строительство.
- Открытие и закрытие лапаротомия (хирургическая процедура, при которой в брюшную полость разрезается открыты, чтобы обеспечить доступ к внутренним органам) обычно выполняется на абсорбирующей прокладки с пластиковой подложке. Перед операцией все необходимые инструменты (например, бритвы, хирургические ножницы, пинцеты, загруженных autoclip объекта применения и т.д.), и материалы (например, PBS, швы, обезболивающим, держатель мыши и вышележащих плиты, и т.д.) должны быть стерилизованы и помещен в хирургической области. Ограничение количества времени разрез открытой очень важна для получения шансы на успех с хирургией. Все животные обработку следует проводить в перчатках, которые были вылечены с МБ-10 решение, или эквивалент. Повторные дезинфекции должны проводиться по мере необходимости, чтобы гарантировать, что перчатки стерильные.
Часть 2. Мышь Анестезия
- Заполните 1 мл шприца с анестезией раствором, содержащим 1 часть Nembutal (50 мг / мл, фенобарбитала) до 4-х частях фильтруется стерилизовать 25 мг / мл сульфата магния в PBS. Это приведет к решению, что составляет 10 мг / мл, фенобарбитала и 20 мг / мл сульфата магния. Каждая мышь должна быть взвешенной индивидуально, и вводили 90 мг фенобарбитала на кг веса тела (например, 28 г мышь бы вводили 250 мкл).
- Вводите в брюшной полости (внутрибрюшинно, IP) от беременной мыши в эмбриональный день (E), 9.5 (можно использовать и другие возрастов по мере необходимости) и проникающей кожи и брюшной мышцы. Разрешить 8-12 минут для мыши, чтобы стать не отвечающих. Адекватная анестезия должна быть подтверждена расслабленной позе животное, и отсутствие движения в ответ на хвосте и ногах пинчей. Аккуратно зажимая между ногти очень чувствительны, и отсутствие какой-либо ответ на такое ущемление показывает, что животные достаточно анестезии. Обратите внимание, даже животных, которые совершенно не реагируют на хвосте и ногах щепотки может несколько раз слегка дергаться в ответ на первоначальный хирургического разреза. Однако, это рефлексивный ответ и не свидетельствует о недостаточной анестезии. Нефтяной основе офтальмологических бальзам следует наносить на глазах мыши, чтобы избежать высыхания во время операции.
- Настройка хирургическое области и ультразвуковые машины в ожидании мышь, чтобы стать наркозом. С использованием ретровируса или лентивирус требует BSL2 сдерживания, как было сказано выше вирусные инъекции должны быть выполнены в Кабинете биобезопасности II. Кроме того, все решения и расходные материалы, что вступает в контакт с вирусом должны быть обеззаражены с 10% гипохлоритом натрия. Хирургические инструменты и ультразвуковое оборудование, следует относиться с стерилизации решения, такие как МБ-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), или эквивалент, используемое объектом под вопросом.
Часть 3. Облучение эмбрионов
- Если это возможно (в зависимости от ограничений данного объекта животного и свободного пространства) он предпочитал иметь хирургическое области подготовки в отдельном месте от хирургической области. Это сведет к минимуму шансы на перекрестное загрязнение между животными. Чтобы начать операцию, место животного на спину на стерильные абсорбирующие мыть области живота тщательно с 70% этанола. Более обширные лечения предоперационного могут быть использованы (например, последовательные раунды Бетадин и 70% моет этанола), но по нашему опыту это не является необходимым для этого вида грызунов хирургии выживания. Использование двойных лезвию бритвы, бритье волос из брюшной полости в области примерно в 1 дюйм шириной и 1,5 см в длину. Используйте короткие быстрые движения с бритвой примерно под углом 45 °. Важно, что хирургическое области быть надлежащим образом лечить, но и не допустить чрезмерного увлажнения, так как это может привести к ненужной охлаждение животного, и, возможно, даже гипотермии.
- Использование тонких хирургических ножниц сделать 1 "продольный разрез через кожу, а затем через брюшную мышцу животного (резка через соединительную ткань холдинга кожи к мышце поможет второй разрез). Обратите внимание, что на протяжении всей процедуры ухода должны быть приняты для обеспечения того, хирургические инструменты остаются бесплодными, и лечение с дезинфицирующим средством должно проводиться по мере необходимости (например, если подсказки вступают в контакт с неправительственными организациями, стераздражать материала).
- Использование пинцета осторожно вытянуть рогов матки и записывать количество эмбрионов на каждой стороне. Оставляя двух соседних эмбрионы подвергаются (выбор из которых два будут зависеть от конфигурации с каждой стороны), место большинство из рогов матки обратно в животное. В этом контексте двух эмбрионов будут выставлены на данный момент времени и купались в PBS, а мать остается на спине.
- Место животного на спине в плексиглас держатель, где она будет во время операции (Figure1A) *. Далее, ниже 10 см культуре ткани блюдо ** (который должен быть вылечены с МБ-10 перед использованием) вниз по матери, с парой щипцов размещены слегка через зеленый силиконовой мембраны (с использованием L RTV силиконовый каучук базы, а отвердитель; Dow-Corning номера продуктов 3142761 и 2156946, соответственно). Как вы нижняя пластина вниз над животными, используйте щипцы для захвата ткани матки между двух эмбрионов для инъекций и осторожно потяните их через мембрану. В то же время, пластина опускается до упора на держатель и чертежные кнопки помещаются в систему, чтобы удерживать его на месте. Предварительно разогреть (до 37 ° С) PBS затем добавляется к блюду, чтобы полностью покрыть эмбрионов.
- Место инъекции этапе содержащие животные и подвержены эмбрионов под ультразвуковым датчиком (Figure1A) для создания в реальном времени изображений подвергается эмбрионы через стенку матки (Figure1B). Зонд затем снизились (с помощью моторизованного контроля) в ванну PBS прямо над эмбрионами для включения в образ. Изображения могут быть получены, когда зонд находится примерно в 2-3 мм от эмбрионов. Очень важно, чтобы убедиться, что наконечник зонда не попадает эмбрионов, как она колеблется туда-сюда собирать изображения.
* Держатель мать лежит в ходе операции могут быть легко сделаны механический цех. Она должна включать широкую базу оргстекло, плексиглас с двумя сторонами наклеенных на вершине, и пространство между ними (ширину, достаточную для мыши, чтобы соответствовать, лежа на спине). Стороны должны иметь долине землю из них, которая затем заполняется черного воска (например, от вскрытия лоток). Это воск служит материал, в который чертежные кнопки будет нажата удерживать пластину PBS, что эмбрионы купаются в во время инъекции.
** 10см бактериальных блюда должны иметь отверстия (около 2 см в диаметре), перфорированные из центра нижней (это может быть сделано с Heavy Duty портативные Панч и 13/16 й дюймовый круговой умереть http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Кроме того, два маленьких отверстия по обе стороны от центрального отверстия (около 1,5 см в гостях) должны быть сожжены с пламенем нагревается иглой (или они могут быть сделаны с дрелью, конечно). Эти отверстия затем покрывается вакуумной смазки и будет где чертежные кнопки, которые держат на пластине держателя протолкнуть в черный воск. Вакуумной смазки является предотвращение PBS от утечки.
Часть 4. Загрузка Касперского в Микроинъекция иглы
- Мода микроинъекции иглы фаски 1 мм (внутренний диаметр) вытащил стеклянный капилляр. Острота иглы имеет решающее значение, и работа с недостаточно острая игла может создать серьезную угрозу проникновения в стенку матки и amnionic мешка, и может привести к экспериментальной неудачи. Заостренные иглы помещается в держатель пипетки, который подключен через трубку к 25 мкл микрошприца установлен в ручной инфузии / вывода насоса (другие устройства могут быть использованы для регулирования загрузки и разгрузки иглы, но это то, что показано на видео). Для оптимального реагирования (чтобы избежать расширения и сжатия связаны с воздух, наполненный системы), микрошприца, трубки и игла должны быть заполнены минеральным маслом.
- Перед загрузкой убедитесь, что игла Есть нет пузырьков воздуха в систему от шприца на всем пути до кончика иглы. Затем нарисуйте назад небольшой пузырек воздуха (1-2 мм в длину) в иглу перед началом загрузки вируса. Этот карманный воздуха помогает поддерживать разделение между вирусом и нефтепродуктов. Вирусные акции для инъекций должны содержать polybrene в конечной концентрации 0,08 мг / мл (для более подробной информации о вирусных производства пожалуйста, обратитесь к ссылки 1, 2). Обратите внимание, что запасы сосредоточены ретровирусных как правило, содержат значительное количество твердых частиц, который содержит большинство инфекционного материала, и поэтому не могут быть отфильтрованы без 5 - 10-кратное падение титра. Кроме того, в зависимости от подготовки, вирусные акции могут быть вязкими из геномной ДНК клетки лизируются упаковки (особенно это актуально при использовании клеток 293, для получения MLV / VSV pseudotyped вируса). Если аликвоту вирус вязкая, небольшое количество ДНКазы я могу и должна быть добавлена, чтобы ослабить акции или загрузки игла будет крайне сложно. капли вирусные акции (8-10 мкл) должен быть сделан на стерильную часть парафильмом в рамках подготовки к игле нагрузки. Затем, используя снятие насоса, тщательно нагрузки иглы обращать внимание, чтобы избежать засорения. Место загружены иглу в микроманипулятора позиции в области инъекции, соблюдая осторожность, чтобы не сломать иглу на эмбрионах, или ультразвуковой датчик. Обратите внимание, что если по некоторым причинам иглы загружается значительно раньше инъекции должно произойти это может быть полезно провести небольшой объем воздуха в наконечник, который может быть освобожден до начала инъекции. Этот карманный воздуха может защитить от вирусной акции сушки на кончике иглы (событие, которое почти всегда оказывают, что загружены иглы бесполезно).
Часть 5. Ультразвуковая руководствуясь Вирусный инъекций
- В режиме реального времени образ, созданный ультразвуковой датчик визуализируется на видеомонитор, и может быть использован для руководства микроинъекции иглу в зародыше. С помощью этой системы вирус может быть введен в амниотической оболочки на E8.5 или любой амниотической полости или желудочковой системы от E9.5-E11.5 (Figure1B). Это самая сложная часть процедуры и требует значительного количества рук на опыт мастера (порядка 5-20 часов в зависимости от следователя). Иглы проявляется в ультразвуковое изображение, как яркие пятна на экране, и ее следует рассматривать, движущейся по корректировке зонд позиции (с помощью моторизованного управления в у и г самолетов, и ручное управление в х плоскости). Крайне важно, что направление колебаний зонда быть параллельны длине иглы. Это будет гарантировать, что кончик иглы находится в плоскости изображения во время движения позиционировать его для закачки в зародыше.
- Эмбрион должен быть расположен так, что целевая область (в этом случае передний мозг желудочка) хорошо видна и доступна для иглы с наименьшим количеством маточного материала в инъекции пути. Кроме того, важно не вводить через плаценту. После регионе целевой мозг выстроились с направлением иглы продвижения (с помощью ручки на микроманипулятора), игла должна быть просто прикоснувшись к стенке матки, а затем короткий быстрый удар вперед должно проникать в ткани. Аналогичный подход используется, чтобы проникнуть amnionic мешок, а затем мозг. В некоторых случаях, и опытный следователь может попасть в желудочек сердца в одно движение, особенно если игла очень острая. Механике перемещения зонда, иглы, и эмбрионов (путем перемещения мать на сцене), требуют практических навыков в освоении.
- Как только необходимое количество эмбрионов были введены, рядом брюшной стенки с 5,0 швов шелка. Механика наложения швов не являются специфическими для данного типа операции. Наконец, использование ветеринарных autoclips для сшивания кожи участие более стежков в брюшной мышцы. Наложение швов на кожу не рекомендуется, потому что мышь будет жевать из швов. Обезболивание должно применяться к области разреза, чтобы уменьшить количество боли, испытываемой мышь, как она пробуждает. Рекомендуется, 0,25% раствор бупивакаина быть введен (0,8 мл / кг, или 2 мг / кг) подкожно каждые несколько миллиметров вдоль разреза.
- В то время как мыши восстанавливает аккуратно лежали животное на фильтровальной бумаги в чистой клетке содержащего геля пакет (для облегчения кормления и гидратации). Место клетке на слайд теплее установлена на уровне 37 ° С для поддержания температуры тела. Когда проснулся, место мыши и гель упаковывают в чистые клетки и вернуться к животным стойку.
- На следующий день проверить мышь для любого влагалищного кровотечения, брюшной схватки, и / или общий проблемными выглядят, и все они указывают на аборт. Если это так, эвтаназии мышь немедленно. Хорошо ухоженные волосы и общий здоровый вид указывают на успешное восстановление после операции. Вводят эмбрионы могут быть принесены в жертву embryonically или постнатально для дальнейшего анализа. Если вирус выражает гена-репортера, например, человека щелочной фосфатазы (PLAP) или GFP, окрашивание будет выявить области положительных вирусной инфекции (Figure1C).
Представитель Результаты
Введенный эмбрионы могут быть принесены в жертву 1-2 дней после инъекции весь путь до конца к взрослой жизни. Если вирус выражает ген-репортер, таких как PLAP или GFP, то репортер выражение служит для выявления инфицированных вирусом клеток и клоны этих клеток. Например, показано на рисунке 1С ткани разделе послеродовой мозга, который был инфицирован внутриутробно при E9.5 с ретровирусных вектор выражения PLAP. Зараженные клетки визуализируется в виде фиолетовой кластеров после гистохимического окрашивания. В дополнение к определению инфицированных вирусом клеток, репортер выражение позволяет изучить морфологию клеток и должность, а также состояние экспрессии генов.
п ">
Рисунок 1. Вирусный инъекции в E9.5 мыши желудочков мозга. А. наркоза животное находится на стадии инъекции. Два эмбрионы будут разоблачены и расположены под ультразвуковым зондом, где это указано (стрелка). Микроинъекции иглы заполнена вирус находится недалеко от эмбрионов и выстроились с ультразвуковым зондом. Б. экрана захвата в режиме реального времени ультразвуковое изображение из эмбриона мыши E9.5. V, желудочка; А.С., амниотической полости; UW, стенки матки. С. Эмбрионы были введены с PLAP экспрессирующих вирус на E10.5. Гистохимические окрашивание на PLAP показывает расположение вирусных событиях инфекции.
Discussion
Вирусный инъекции с использованием ультразвука можно проводить с E8.5-E11.5, где только амниотической оболочки могут быть введены в E8.5, в то время как в амниотической полости желудочковой системы и могут быть введены из-E9.5 E11.5. При правильном выполнении вирусные частицы вводят в желудочковой системе с помощью ультразвука имеют доступ к клеток, выстилающих желудочковой системы и, следовательно, могут заразить различных структур переднего мозга (коры головного мозга, базальных ганглиев, промежуточного мозга, глаз и т.д.), среднего мозга и задний мозг (Figure1C). Вирус вводится в амниотической полости имеет доступ к клеткам на внешней стороне эмбриона. В дополнение к вирусу, ультразвуковой контроль также может быть использована для введения клеток в развивающемся эмбрионе. Таким образом, этот метод предусматривает несколько вариантов на выбор (период развития времени, структуры, вирус / клеток) при проектировании эксперимента.
Очень важно, чтобы вводят вирус или клетки экспрессируют репортер для облегчения идентификации зараженных / в вводят клетки. Исторически сложилось так, человеческий плацентарный щелочной фосфатазы (PLAP) или GFP были использованы. Из опыта, мы нашли PLAP может быть очень полезно ген-репортер, поскольку оба PLAP гистохимических и иммуногистохимических окрашивание дает резкий и четкий одной клетки окраску, которая позволяет анализировать морфологию клеток и положение, и на проведение клонального анализа. Поскольку вирусные выражения GFP может быть слабым, репортер GFP не может быть идеальным для окрашивания тканей, но и полезно, если кто-то хочет получить отдельные клетки флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micromanipulator | Narishige International | 91084361683D | |
| HI-7 pipette holder | Narishige International | 9108436141 | |
| 10 mm support arm | Carl Zeiss, Inc. | 9108436206 | |
| IP iron base plate | Carl Zeiss, Inc. | 9108436167 | |
| CI-1 connector for pipette holder | Carl Zeiss, Inc. | 9108436257 | |
| 1mm ID tubing | Carl Zeiss, Inc. | 911013 | |
| 3-way luer lock stopcock (pkg 10) | Carl Zeiss, Inc. | K420163-4503 | |
| Motor controller, 2-4 axes | Newport Corp. | 860-c2 | |
| Joystick | Newport Corp. | PMC200-J | |
| Micrometer adapter | Newport Corp. | ADAPT-BM17-375 | |
| Motorized drive | Newport Corp. | CMA-25CC | |
| Cable assembly | Newport Corp. | 860I-10 | |
| 25 mm translation stage | Newport Corp. | UMR8-25 | |
| Micrometer | Newport Corp. | BM17-25 | |
| Base plate | Newport Corp. | M-PBN8 | |
| Inner mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-I | |
| Outer mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-E | |
| Man. infusion/withdrawl pump | Stoelting Co. | 51222 | |
| 25 μl microsyringe | Stoelting Co. | 51113 | |
| 24"x12"x0.5" metric board plate | Edmund Scientific | NT03-640 | |
| Set of self-adjusting feet | Edmund Scientific | NT34-841 | |
| Bar-type lens holder | Edmund Scientific | NT03-669 | |
| Right angle post clamp | Edmund Scientific | NT53-357 | |
| 2" post holder | Edmund Scientific | NT03-646 | |
| 4” steel post | Edmund Scientific | NT36-499 | |
| 6” steel post | Edmund Scientific | NT36-503 | |
| 12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2" | Edmund Scientific | NT03-644 | |
| PBS, pH7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | Numerous options | |
| Double Edge Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| 1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8 | BD Biosciences | 329412 | |
| Autoclip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| Autoclips, 9mm (to close skin incision) | BD Biosciences | 427631 | |
| 5.0 Silk sutures | Fisher Scientific | S-1173 | |
| Sterilube ophthalmic ointment | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | |
| MB-10 or equivalent disinfectant | Quip labs | ||
| 10% bleach | Multiple Suppliers | ||
"One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging.
Anesthetic and Analgesic The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain. The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical. |
|||
References
- Yee, J. K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).
- Gaiano, N. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
