Summary
I livmodern överlevnad kirurgi hos möss tillåter molekylära manipulation av genuttryck under utveckling. Här beskriver vi användning av högfrekvent ultraljud för att styra insprutning av retrovirala vektorer i musen hjärnan på embryonala dag (E) 9.5.
Abstract
I livmodern överlevnad kirurgi hos möss tillåter molekylära manipulation av genuttryck under utveckling. Men eftersom livmoderväggen är ogenomskinlig under tidig embryogenes, är förmågan att rikta specifika delar av embryon för mikroinjektion starkt begränsad. Lyckligtvis tillåter högfrekvent ultraljud generering av bilder som kan användas i realtid för att styra en mikroinjektion nål i embryonala regionen av intresse. Här beskriver vi användningen av sådan avbildning att vägleda injektion av retrovirala vektorer i ventrikulära systemet för musen framhjärnan på embryonala dag (E) 9.5. Denna metod använder en laparotomi för att tillåta åtkomst till livmodern horn, och en specialdesignad platta som tillåter värd embryon badar i saltlösning medan de avbildas och injiceras. Framgångsrika operationer resulterar ofta i de flesta eller alla av den injicerade embryona överlevande till någon senare tidpunkt av intresse (embryonically eller postnatalt). De principer som beskrivs här kan användas med smärre ändringar för att utföra injektioner i amnionic vätska i E8.5 embryon (vilket tillåter infektion längs främre bakre omfattningen av neuralrörsdefekter, som ännu inte har stängt), eller i ventrikulära systemet för hjärnan på E10.5/11.5. Vidare i mitten av neurogen åldrar (~ E13.5), kan ultraljud användas direkt injektion i specifika delar av hjärnan för virusinfektion eller celltransplantation. Användningen av ultraljud för att guida i livmodern injektioner i möss är en mycket kraftfull teknik som möjliggör den molekylära och cellulära manipulation av musembryon på ett sätt som annars skulle vara utomordentligt svårt om inte omöjligt.
Protocol
Del 1. Förbered operationsområdet
- Om att arbeta med biologiskt reagens (t.ex. retrovirala vektorer), bör operation utföras i ett biosäkerhet II skåp (BSC). Ultraljudet backscatter mikroskop (UBM) bör sitta bredvid BSC, med givaren inne i BSC, och hålls på plats av en motor kontrollerad stöd på en speciellt utformad kirurgiskt stadium. De komponenter som behövs för att bygga scenen som visas i videon är noterade på linjen. Denna lista, tillsammans med bilder av scenen från flera vinklar (på begäran), bör tillåta byggande.
- Öppning och stängning av laparotomi (kirurgiskt ingrepp där bukhålan skärs öppen för att tillåta åtkomst till de inre organen) är oftast utförs på ett absorberande dyna med plast baksida. Före operation alla nödvändiga verktyg (t.ex. rakhyvel, kirurgisk sax, pincett, laddad autoclip applier etc.) bör, och material (t.ex. PBS, suturer, narkos, musen hållaren och överliggande platta, etc.) steriliseras och placeras i operationsområdet. Att begränsa den tid snittet är öppen är viktigt för att maximera chanserna att lyckas med operationen. Alla djurhantering skall utföras med handskar som har desinficerats med MB-10-lösning, eller motsvarande. Upprepade desinfektion bör utföras efter behov för att säkerställa att handskarna är sterila.
Del 2. Mus Anesthesia
- Fyll en 1 cc spruta med bedövningsmedel som innehåller 1 del Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) till 4 delar filtrerade steriliserade 25 mg / ml magnesiumsulfat i PBS. Detta kommer att resultera i en lösning som är 10 mg / ml pentobarbital och 20 mg / ml magnesiumsulfat. Varje mus ska viktas individuellt och injiceras med 90 mg pentobarbital per kg kroppsvikt (t.ex. skulle en 28 GM mus injiceras med 250 mikroliter).
- Injicera i buken (intraperitoneal, IP) för en gravid musen på embryonala dag (E) 9,5 (kan använda andra åldrar som behövs) tränger både hud och buken muskler. Låt 8-12 minuter för musen för att bli icke-lyhörd. Adekvat anestesi bör bekräftas av avslappnad hållning av djur, och brist på rörelse som svar på svansen och klämmer tå. Försiktigt klämma mellan finger naglar är mycket känslig, och avsaknad av svar på sådana nypa tyder på att djuren är tillräckligt sövd. Observera även djur som är helt okänsliga för svans och tå nyper kan ibland rycka något svar på den första kirurgiska ingreppet. Detta är dock en reflexiv respons och tyder inte på otillräcklig anestesi. Petroleumbaserade oftalmologiska salva bör tillämpas ögonen på musen för att undvika uttorkning under operation.
- Set-up operationsområdet och ultraljud maskin i väntan på musen för att bli sövd. Eftersom användningen av retrovirus eller lentivirus kräver BSL2 inneslutning, som nämnts ovan den virala injektioner bör utföras i en biosäkerhet II kabinett. Dessutom bör alla lösningar och engångsmaterial som kommer i kontakt med viruset dekontamineras med en 10% blekmedel. Den kirurgiska verktyg och ultraljudsutrustning bör behandlas med en steriliserande lösning som MB-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), eller motsvarande som används av anläggningen i fråga.
Del 3. Exponering av embryona
- Om möjligt (beroende på begränsningar av den givna Djuranläggningen och tillgängligt utrymme) är det att föredra att ha kirurgisk förberedelse område på en annan plats från det kirurgiska området. Detta kommer att minimera risken för korskontaminering mellan djur. Att inleda operationen, placera djuret på rygg på en steril absorberande yta och tvätta buken noggrant med 70% etanol. Mer omfattande prekirurgisk behandlingar kan användas (t.ex. successiva Betadine och 70% tvättar etanol), men vår erfarenhet är detta inte nödvändigt för denna typ av gnagare överlevnad kirurgi. Med hjälp av en dubbel kant rakkniv, raka håret från buken i ett område på cirka 1 cm bred och 1,5 inches lång. Använd korta snabba rörelser med rakkniv vid ca 45 ° vinkel. Det är viktigt att den kirurgiska området lämpligen behandlas, men inte utsätts för alltför blöta, eftersom detta kan resultera i onödiga kylning av djuret, och kanske till och hypotermi.
- Använda fina kirurgiska saxar gör en "längsgående snitt genom huden först, och sedan genom magmuskelstation av djuret (skär genom bindväv som håller huden för att muskeln ska hjälpa till med andra snitt). Observera att hela förfarandet försiktighet vidtas för att säkerställa att kirurgiska instrument förblir sterila, och behandling med desinfektionsmedel bör utföras som behövs (dvs. om verktygstips kommer i kontakt med icke-steIRRITERA material).
- Använd pincett dra försiktigt ut livmodern horn och registrera antalet embryon på varje sida. Medan två intilliggande exponerade embryon (urval av vilka två kommer att bero på den konfiguration på varje sida), placera större delen av livmodern hornen tillbaka in i djuret. I detta sammanhang kommer två embryon att exponeras vid en given tidpunkt och badade i PBS, medan mamman kvar på hennes rygg.
- Placera djuret på rygg i plexiglas hållaren där den under operationen (Figure1A) *. Därefter sänker 10cm maträtt vävnadsodling ** (som bör desinficeras med MB-10 före användning) ner över mor, med en pincett placeras något genom den gröna silastic membranet (görs med L RTV silikongummi bas, och härdare, Dow-Corning produktnummer 3142761 och 2156946, respektive). Som du sänker plattan ner över djuret, använd pincett att greppa livmoder vävnad mellan de två embryon som skall injiceras, och försiktigt dra dem genom membranet. Samtidigt är plattan sänks helt ner på hållaren, och häftstift skjuts in för att hålla den på plats. Förvärmda (till 37 ° C) PBS läggs sedan till skålen för att helt täcka embryon.
- Placera injektionen scenen med djuret och exponerade embryon under ultraljudssond (Figure1A) för att skapa realtid avbildning av exponerade embryon genom livmoderväggen (Figure1B). Sonden är då sänks (med motoriserad styr) i PBS badet direkt över de embryon som skall avbildas. Bilder kan erhållas när sonden är ca 2-3 mm från embryon. Det är mycket viktigt att se till att sonden huvudet inte slår de embryon som den oscillerar fram och tillbaka för att samla in bilder.
* Innehavaren mamman vilar i under operation kan lätt göras med en mekanisk verkstad. Den bör omfatta ett brett plexiglas bas, med två plexiglas sidor limmade på topp, och ett utrymme i mellan dem (tillräckligt bred för musen för att passa liggande på rygg). Sidorna bör ha en dal grund av dem, som sedan fylls med svart vax (t.ex. från en dissektion fack). Det vax fungerar som material i vilka häftstift kommer att pressas att hålla nere plattan PBS att embryona badar i under injektion.
** 10cm bakteriell rätter bör ha ett hål (ca 2 cm i diameter) stansas ut från mitten av botten (detta kan göras med en Heavy Duty Portable Punch och en 13/16: e tums cirkulär dö: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Dessutom bör två små hål på vardera sidan om hålet i mitten (ca 1,5 cm bort) brännas ut med en flamma uppvärmd nål (eller de kan göras med en borr förstås). Dessa hål är sedan täcks med vakuum fett och kommer vara där häftstift som håller plåten på hållaren driva igenom i den svarta vax. Det vakuum fett är att förhindra att PBS från att läcka ut.
Del 4. Laddar Virus i en mikroinjektion Needle
- Fashion en mikroinjektion nål genom avfasning en 1mm (innerdiameter) drog glas kapillär. Skärpan i nålen är kritisk, och arbetar med ett otillräckligt vass nål kan allvarligt äventyra penetration av livmoderväggen och amnionic sac, och kan leda till experimentella misslyckande. Den vässade nål placeras sedan i pipetten hållaren, som är ansluten via slangen till en 25 mikroliter mikrospruta monterad i en manuell infusion / tillbakadragande pump (andra enheter kan användas för att reglera lastning och lossning av nålen, men detta är vad som visas i videon). För optimal respons (för att undvika expansion och kompression i samband med en fylld luftsystem) bör mikrospruta slang och nål fyllas med mineralolja.
- Före lastning nålen se till att det inte finns några luftbubblor i systemet från sprutan hela vägen till toppen av nålen. Sen dra tillbaka en liten luftbubbla (1-2 mm lång) i nålen innan start för att ladda virus. Denna luftficka bidrar till att upprätthålla separationen mellan virus och mineralolja. Den virala materiel som skall injiceras bör innehålla polybrene till en slutlig koncentration av 0,08 mg / ml (för mer information om viruset produktion se referenser 1, 2). Observera att koncentreras retrovirus lager i allmänhet innehåller en stor mängd partiklar, som innehåller merparten av den smittsamma material, och kan därför inte filtreras bort utan en 5 - till 10-faldig minskning titer. Dessutom, beroende på att förbereda, kan den virala beståndet trögflytande från arvsmassans DNA lyserade förpackningar celler (gäller särskilt om du använder 293 celler för att generera MLV / VSV pseudotyped virus). Om delprov av viruset är trögflytande, en liten mängd DNAse jag kan och bör läggas till lossa lager, eller lastning nålen kommer att bli oerhört svårt. En droppe av viral beståndet (8-10 mikroliter) bör placeras på en steril bit parafilm inför nål lastning. Använd sedan tillbakadragandet pumpen försiktigt ladda nålen uppmärksamma att undvika träskor. Placera den laddade kanylen i mikromanipulator position i injektionsområde, försiktigt så att inte bryta nålen på embryon, eller ultraljudssond. Observera att om du av någon anledning nålen laddas betydligt innan injektionen ska ske kan det vara bra att dra en liten mängd luft i spetsen, som kan släppas före start av injektioner. Denna luftficka kan skydda mot virus lager torkning vid spetsen av nålen (en händelse som nästan alltid gör att laddade nål värdelös).
Del 5. Ultraljud Guidad Viral Injection
- I realtid bild som skapats av ultraljudssond visualiseras på video monitor, och kan användas för att styra mikroinjektion nålen i embryot. Med detta system viruset kan sprutas in i fostersäcken på E8.5 eller antingen fostersäcken eller ventrikulära systemet från E9.5-E11.5 (Figure1B). Detta är den svåraste delen av förfarandet och kräver en stor mängd praktisk erfarenhet för att bemästra (i storleksordningen 5-20 timmar beroende på utredaren). Nålspetsen är uppenbar i ultraljud bilden som den ljusaste punkten på skärmen, och bör ses röra sig i enlighet med den anpassning av sonden läge (med hjälp av motoriserade kontrollerna i y och z plan, och den manuella kontrollen i x plan). Det är oerhört viktigt att den svängning riktning sonden parallellt med nålen. Detta kommer att säkerställa att nålspetsen kvar i bildplanet under rörelser för att placera den för injektion i embryot.
- Embryot bör placeras så att målet regionen (i detta fall framhjärnan ventrikeln) är väl synlig och är tillgängligt för nålen med minsta livmodern material i injektionen vägen. Dessutom är det viktigt att inte injicera via moderkakan. När målet för hjärnan regionen är uppradade med riktningen av nål avancemang (med hjälp av ratten på mikromanipulator), bör nålen precis når livmoderväggen och sedan en kort snabb stöt framåt ska tränga in i vävnaden. Ett liknande tillvägagångssätt används för att penetrera amnionic sac och hjärnan. I vissa fall kan och erfaren utredare träffade ventrikeln i en rörelse, särskilt om nålen är mycket vass. Mekaniken för att flytta sonden, nålen och embryon (genom att flytta mamman på scenen), kräver praktisk övning att behärska.
- När önskat antal embryon har injicerats, nära bukväggen med 5,0 silke suturer. Mekanik suturering är inte specifika för denna typ av kirurgi. Slutligen använder veterinär autoclips att häfta ihop huden över stygn i buken muskler. Suturering av huden rekommenderas inte eftersom musen kommer att tugga ut stygnen. Smärtlindring ska appliceras på snittet området för att minska smärta upplevs av musen som den väcker. Det rekommenderas att en 0,25% Bupivakain lösningen injiceras (0,8 ml / kg eller 2 mg / kg) subkutant varannan millimeter längs snittet webbplats.
- Medan musen återhämtar sig försiktigt lägga djuret på absorberande papper i en ren bur som innehåller en gel pack (för att underlätta utfodring och släckning). Placera buren på en bild varmare inställd på 37 ° C för att upprätthålla kroppstemperaturen. När vaknade, placera musen och gelpackning i en ren bur och återgå till djuret racket.
- Följande dag kontrollerar musen för vaginal blödning, mag-sammandragningar och / eller en total used look, som alla indikerar abort. Om så är fallet, euthanize musen omedelbart. Välvårdad hår och en övergripande frisk utseende tyder på en framgångsrik återhämtning från kirurgi. Den injicerade embryona kan offras embryonically eller postnatalt för vidare analys. Om viruset uttrycker en reporter gen, såsom mänskliga alkaliska fosfataser (PLAP) eller GFP, kommer en färgning avslöja delar av positiva virusinfektion (Figure1C).
Representativa resultat
Injiceras embryon kan offras 1-2 dagar efter injektionen hela vägen till vuxenlivet. Om viruset uttrycker en reporter gen, såsom PLAP eller GFP, då reporter uttryck tjänar till att identifiera viralt infekterade celler och kloner av dessa celler. Till exempel visas i figur 1C är en vävnad avsnitt av en postnatal hjärna som smittats in utero vid E9.5 med ett retrovirus vektor som uttrycker PLAP. Infekterade celler visualiseras som lila klasar efter histokemiska färgning. Förutom att identifiera viralt infekterade celler, låter reporter uttryck man undersöka cellmorfologin och position, liksom genuttryck status.
nt ">
Figur 1. Viral injektion i E9.5 musen framhjärnan ventriklarna. A. sövda djur placeras på injektionsstället scenen. Två embryon skulle exponeras och placeras under ultraljudssond där anges (pil). Det mikroinjektion nål fylld med viruset ligger nära embryon och ställde upp med ultraljud givare. B. skärmdump av en i realtid ultraljud bild från en E9.5 mus embryo. V, ventrikel, AS, fostersäcken, UW, livmoderväggen. C. Embryon injicerades med en PLAP-uttrycker viruset vid E10.5. Histokemiska färgning för PLAP avslöjar var virusinfektion händelser.
Discussion
Viral injektioner med ultraljud vägledning kan bedrivas från E8.5-E11.5, där endast de fostersäcken kan injiceras på E8.5, medan både fostersäcken och ventrikulära systemet kan injiceras från E9.5-E11.5. När utförs korrekt, viruspartiklar injiceras i ventrikulära systemet med hjälp av ultraljud vägledning har tillgång till de celler som kantar ventrikulära systemet och därför kan infektera de olika strukturerna i framhjärnan (hjärnbarken, basala ganglierna, diencephalon, ögon, etc.), mitthjärnan och hindbrain (Figure1C). Virus sprutas in i fostersäcken har tillgång till cellerna på utsidan av embryot. Förutom virus, kan ultraljud också användas för att injicera celler i det växande embryot. Därför ger denna teknik flera alternativ att välja mellan (fosterskadande tid, struktur, virus / celler) när man utformar ett experiment.
Det är avgörande att den injicerade viruset eller celler uttrycker en reporter för enkel identifiering av infekterade / injicerat celler. Historiskt sett har mänskliga moderkakan alkaliskt fosfatas (PLAP) eller GFP använts. Av erfarenhet har vi funnit PLAP kan vara ett mycket användbart reporter genen eftersom både PLAP histokemiska och immunhistokemisk färgning ger en skarp och tydlig en enda cell fläck som gör att man kan analysera cellmorfologin och ställning, och att genomföra en klonal analys. Eftersom viral GFP uttryck kan vara svag, kan en GFP reporter inte vara idealiska för färgning vävnad, men är användbart om man vill få fram enskilda celler med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micromanipulator | Narishige International | 91084361683D | |
| HI-7 pipette holder | Narishige International | 9108436141 | |
| 10 mm support arm | Carl Zeiss, Inc. | 9108436206 | |
| IP iron base plate | Carl Zeiss, Inc. | 9108436167 | |
| CI-1 connector for pipette holder | Carl Zeiss, Inc. | 9108436257 | |
| 1mm ID tubing | Carl Zeiss, Inc. | 911013 | |
| 3-way luer lock stopcock (pkg 10) | Carl Zeiss, Inc. | K420163-4503 | |
| Motor controller, 2-4 axes | Newport Corp. | 860-c2 | |
| Joystick | Newport Corp. | PMC200-J | |
| Micrometer adapter | Newport Corp. | ADAPT-BM17-375 | |
| Motorized drive | Newport Corp. | CMA-25CC | |
| Cable assembly | Newport Corp. | 860I-10 | |
| 25 mm translation stage | Newport Corp. | UMR8-25 | |
| Micrometer | Newport Corp. | BM17-25 | |
| Base plate | Newport Corp. | M-PBN8 | |
| Inner mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-I | |
| Outer mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-E | |
| Man. infusion/withdrawl pump | Stoelting Co. | 51222 | |
| 25 μl microsyringe | Stoelting Co. | 51113 | |
| 24"x12"x0.5" metric board plate | Edmund Scientific | NT03-640 | |
| Set of self-adjusting feet | Edmund Scientific | NT34-841 | |
| Bar-type lens holder | Edmund Scientific | NT03-669 | |
| Right angle post clamp | Edmund Scientific | NT53-357 | |
| 2" post holder | Edmund Scientific | NT03-646 | |
| 4” steel post | Edmund Scientific | NT36-499 | |
| 6” steel post | Edmund Scientific | NT36-503 | |
| 12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2" | Edmund Scientific | NT03-644 | |
| PBS, pH7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | Numerous options | |
| Double Edge Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| 1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8 | BD Biosciences | 329412 | |
| Autoclip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| Autoclips, 9mm (to close skin incision) | BD Biosciences | 427631 | |
| 5.0 Silk sutures | Fisher Scientific | S-1173 | |
| Sterilube ophthalmic ointment | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | |
| MB-10 or equivalent disinfectant | Quip labs | ||
| 10% bleach | Multiple Suppliers | ||
"One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging.
Anesthetic and Analgesic The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain. The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical. |
|||
References
- Yee, J. K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).
- Gaiano, N. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
