Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

Summary

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l'utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Abstract

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Tuttavia, poiché la parete uterina è opaco durante l'embriogenesi precoce, la possibilità di individuare specifiche parti dell'embrione per microiniezione è molto limitata. Fortunatamente, ad alta frequenza ecografia permette la generazione di immagini che possono essere utilizzati in tempo reale per guidare un ago microiniezione nella regione embrionale di interesse. Qui si descrive l'uso di imaging, per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel sistema ventricolare del prosencefalo topo al giorno embrionale (E) 9.5. Questo metodo utilizza una laparotomia per consentire l'accesso ai corni uterini, e un piatto appositamente progettato che permette di ospitare gli embrioni di essere immerso in soluzione salina mentre sono ripreso e iniettata. Interventi chirurgici di successo spesso sfociano in tutti o quasi tutti gli embrioni iniettati sopravvivere a qualsiasi momento successivo punto di interesse (embrionalmente o dopo la nascita). I principi qui descritto può essere usato con lievi modifiche per eseguire le iniezioni nel liquido amniotico di E8.5 embrioni (permettendo così l'estensione dell'infezione lungo anteriore posteriore del tubo neurale, che non è ancora chiuso), o nel sistema ventricolare del cervello E10.5/11.5. Inoltre, a metà neurogeno età (~ E13.5), ecografia può essere usata l'iniezione diretta in regioni specifiche del cervello per infezione virale o trapianto di cellule. L'uso di ecografia per guidare in utero iniezioni nei topi è una tecnica molto potente che permette la manipolazione molecolare e cellulare di embrioni di topo in un modo che sarebbe altrimenti estremamente difficile se non impossibile.

Protocol

Parte 1. Preparare l'area chirurgica

1. Se si lavora con reagenti rischio biologico (ad esempio vettori retrovirali), l'intervento deve essere eseguito all'interno di un armadio II Biosicurezza (BSC). Il microscopio backscatter ultrasuoni (UBM) dovrebbe sedersi accanto al BSC, con il trasduttore all'interno della BSC, e tenuto in posizione da un supporto motore controllato su un palco appositamente progettato chirurgica. I componenti necessari per costruire lo stadio mostrato nel video sono elencati in linea. Questo elenco, insieme ad immagini della scena da diverse angolazioni (disponibile a richiesta), dovrebbe consentire la costruzione.
2. L'apertura e chiusura della laparotomia (procedura chirurgica in cui viene tagliata la cavità addominale aperta per consentire l'accesso agli organi interni) è di solito eseguita su un tampone assorbente con supporto di plastica. Prima dell'intervento tutti gli strumenti necessari (es. rasoio, forbici chirurgiche, pinze, caricato autoclip applicatore, ecc) e materiali (ad esempio PBS, suture, anestetico, il supporto per mouse e la piastra sovrastante, ecc) devono essere sterilizzati e collocato nel Area chirurgica. Limitando la quantità di tempo l'incisione è aperto è importante per ottimizzare le possibilità di successo con la chirurgia. Tutti trattamento degli animali deve essere effettuata con guanti che sono stati disinfettati con MB-10 soluzione, o equivalente. Disinfezione ripetuta deve essere eseguita secondo necessità per assicurare che i guanti sono sterili.

Parte 2. Anestesia del mouse

1. Riempire una siringa da 1 cc, con la soluzione anestetica contenente 1 parte di Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) a 4 parti filtrata sterile 25 mg / ml di solfato di magnesio in PBS. Questo si tradurrà in una soluzione che è di 10 mg / ml pentobarbital e 20 mg / ml di solfato di magnesio. Ogni mouse dovrebbe essere ponderata individualmente, e iniettati con 90 mg di pentobarbital per kg di peso corporeo (per esempio, di 28 topo gm sarebbe iniettato con 250 mL).
2. Iniettare nell'addome (intraperitoneale, IP) di un topo in stato di gravidanza al giorno embrionale (E) 9.5 (possono usare altre età, se necessario) penetrante sia la pelle ei muscoli addominali. Lasciare 8-12 minuti per il mouse per non rispondere. Anestesia adeguata dovrebbe essere confermato dalla postura rilassata dell'animale, e la mancanza di movimento in risposta a coda e pizzichi piedi. Pizzicando delicatamente tra le unghie è molto sensibile, e la mancanza di qualsiasi risposta a pizzicare tale indica che l'animale sia sufficientemente anestetizzati. Si noti anche gli animali che sono completamente insensibili a pizzichi coda e punta può alcune volte contrazione leggermente in risposta alla prima incisione chirurgica. Tuttavia, questa è una risposta riflessiva e non indica l'anestesia inadeguata. A base di petrolio balsamo oftalmico deve essere applicato agli occhi del mouse per evitare l'essiccamento durante l'intervento.
3. Set-up l'area chirurgica e la macchina ad ultrasuoni in attesa del mouse per diventare anestetizzati. Poiché l'uso di retrovirus e lentivirus richiede BSL2 di contenimento, come detto in precedenza le iniezioni virale deve essere eseguita in un gabinetto biosicurezza II. Inoltre, tutte le soluzioni e materiali usa e getta che viene a contatto con il virus dovrebbe essere decontaminate con una soluzione di candeggina al 10%. Gli strumenti chirurgici e apparecchiature ad ultrasuoni devono essere trattati con una soluzione sterilizzante come MB-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ) o un equivalente utilizzato dalla struttura in questione.

Parte 3. Esposizione della embrioni

1. Se possibile (a seconda dei vincoli della struttura determinato animale e lo spazio disponibile), si preferisce avere l'area chirurgica preparazione in un luogo separato dalla zona chirurgica. Questo ridurrà al minimo le possibilità di contaminazione incrociata tra gli animali. Per avviare l'intervento, posto l'animale sul dorso su una superficie sterile assorbente e lavare la zona addominale accuratamente con etanolo al 70%. Trattamenti prechirurgica più ampia può essere impiegata (ad esempio, turni successivi di Betadine e lavaggi etanolo al 70%), ma nella nostra esperienza questo non è necessario per questo tipo di chirurgia roditori sopravvivenza. Utilizzando un rasoio a doppio taglio, radere i capelli con l'addome in una zona di circa 1 cm di larghezza e 1,5 centimetri di lunghezza. Utilizzare brevi movimenti rapidi con il rasoio a circa un angolo di 45 °. E 'importante che l'area chirurgica essere opportunamente trattata, ma non sottoposto a bagnatura eccessiva, in quanto ciò può causare agghiacciante inutile degli animali, e forse anche l'ipotermia.
2. Utilizzando bene forbici chirurgiche fare un 1 "incisione longitudinale attraverso la pelle, e poi attraverso il muscolo addominale dell'animale (taglio attraverso il tessuto connettivo tenendo la pelle al muscolo aiuterà con la seconda incisione). Noti che per tutta la cura procedura dovrebbe da adottare per assicurare che gli strumenti chirurgici rimangono sterili, e il trattamento con disinfettante deve essere eseguito secondo le necessità (cioè se le punte di entrare in contatto con i non-sterile materiale).
3. Forcipe utilizzando attentamente tirare fuori le corna uterine, e registrare il numero di embrioni da ogni lato. Pur lasciando due embrioni adiacenti esposti (selezione di cui due dipenderà dalla configurazione su ogni lato), posto la maggior parte delle corna uterine nuovamente dentro l'animale. In questo contesto, due embrioni saranno esposti in un dato momento e bagnato in PBS, mentre la madre rimane sulla schiena.
4. Posto l'animale sul dorso nel supporto in plexiglass dove sarà durante l'intervento chirurgico (Figure1A) *. Successivamente, abbassare il tessuto piatto 10 centimetri cultura ** (che dovrebbe essere disinfettato con MB-10 prima dell'uso) giù sopra la madre, con un paio di pinze posizionati leggermente attraverso la membrana verde silastic (realizzati con L silicone RTV base in gomma, e catalizzatore;-Dow Corning numeri di prodotto 3142761 e 2156946, rispettivamente). Mentre si abbassa il piatto sopra l'animale, utilizzare la pinza per afferrare il tessuto uterino tra i due embrioni da iniettare, e delicatamente tirare attraverso la membrana. Allo stesso tempo, la lastra si abbassa completamente verso il basso sul supporto, e le puntine da disegno sono spinti per tenerlo in posizione. Pre-riscaldato (a 37 ° C) PBS viene quindi aggiunto il piatto per coprire completamente gli embrioni.
5. Posizionare la fase di iniezione contenente l'animale e gli embrioni esposti sotto la sonda ecografica (Figure1A) per creare in tempo reale immagini degli embrioni esposti attraverso la parete uterina (Figure1B). La sonda viene quindi abbassato (utilizzando i comandi motorizzati) nel bagno di PBS direttamente sopra gli embrioni da acquisire. Le immagini possono essere ottenuti quando la sonda è di circa 2-3 mm di distanza dalla embrioni. E 'molto importante fare in modo che la sonda non colpisce gli embrioni in quanto oscilla avanti e indietro per raccogliere le immagini.

* Il titolare della madre riposa in durante l'intervento chirurgico può essere facilmente effettuata da un officina meccanica. Esso dovrebbe includere una larga base in plexiglass, con due lati plexiglass incollato sulla parte superiore, e uno spazio tra di loro (abbastanza largo per il mouse per adattarsi mentre giaceva sul dorso). Le parti dovrebbero avere un terreno valle fuori di essi, che viene poi riempito con cera nera (per esempio da un vassoio dissezione). Cera che serve come il materiale in cui puntine da disegno sarà premuto per tenere premuto il piatto di PBS che gli embrioni sono immersi in durante l'iniezione.

** Piatti 10 centimetri batterica dovrebbe avere un foro (circa 2 centimetri di diametro) perforato dal centro del fondo (questo può essere fatto con un Heavy Duty portatile Punch e un 13/16 ^° morire pollici circolare: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Inoltre, due piccoli fori su entrambi i lati del foro centrale (circa 1,5 centimetri di distanza) deve essere bruciato con una fiamma riscaldato ago (o potrebbero essere effettuato con un trapano, naturalmente). Questi fori vengono poi coperti di grasso per vuoto e sarà dove il puntine che tengono la piastra sul supporto nel far passare la cera nera. Il grasso è vuoto per evitare la fuoriuscita dalla PBS.

Parte 4. Caricamento Virus in un ago Microiniezione

1. Moda microiniezione di un ago smusso appena 1 mm (diametro interno) tirato capillare di vetro. La nitidezza dell'ago è critica, e lavorando con un ago sufficientemente forte può seriamente compromettere la penetrazione della parete uterina e il sacco amniotico, e può portare al fallimento sperimentale. L'ago affilato è poi inserito nel supporto pipetta, che è collegato tramite tubo a una microsiringa 25 microlitri montato in un manuale di infusione / ritiro della pompa (altri dispositivi possono essere usati per regolare il carico e lo scarico dell'ago, ma questo è ciò che è mostrato nel video). Per la risposta ottimale (per evitare l'espansione e la compressione associata ad un sistema ad aria piena), la microsiringa, tubi, e l'ago dovrebbe essere riempita con olio minerale.
2. Prima di caricare l'ago assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel sistema dalla siringa fino alla punta dell'ago. Poi ritiratevi una piccola bolla d'aria (1-2 mm di lunghezza) nel l'ago prima di iniziare a caricare virus. Questa sacca d'aria aiuta a mantenere la separazione tra il virus e l'olio minerale. Lo stock virale da iniettare deve contenere polibrene ad una concentrazione finale di 0,08 mg / ml (per ulteriori informazioni sulla produzione di virus si rimanda a riferimenti 1, 2). Si noti che concentra le scorte retrovirali generalmente contengono una significativa quantità di particolato, che contiene la maggior parte del materiale infetto, e quindi non possono essere filtrati senza un 5 - a goccia di 10 volte del titolo. Inoltre, a seconda della preparazione, lo stock virale può essere viscoso dal DNA genomico di cellule lisate imballaggio (particolarmente vero se si usa 293 cellule per generare MLV / VSV virus pseudotyped). Se l'aliquota del virus è viscoso, una piccola quantità di DNasi I può e deve essere aggiunto per allentare lo stock, o caricando l'ago sarà estremamente difficile. A goccia del titolo virale (8-10 mL) deve essere collocato su un pezzo di parafilm sterile in preparazione per il carico ago. Quindi, utilizzando la pompa di recesso, accuratamente caricare l'attenzione ago pagare per evitare intasamenti. Posizionare l'ago caricato nella posizione micromanipolatore nella zona di iniezione, facendo attenzione a non rompere l'ago sulla embrioni, o la sonda ecografica. Si noti che se per qualche motivo l'ago viene caricato in maniera significativa prima che l'iniezione è che si verifichi può essere utile per disegnare una piccola quantità di aria nella punta, che può essere scaricato prima di iniziare le iniezioni. Questa sacca d'aria in grado di proteggere contro il calcio virale essiccazione sulla punta dell'ago (un evento che sarà quasi sempre di rendering che l'ago caricato inutile).

Parte 5. Ecografia iniezione guidate Viral

1. L'immagine in tempo reale creato dalla sonda ecografica viene visualizzata sul monitor video, e può essere utilizzato per guidare l'ago microiniezione in embrione. Utilizzando questo virus sistema può essere iniettato nel sacco amniotico a E8.5 o sia il sacco amniotico o il sistema ventricolare da E9.5-E11.5 (Figure1B). Questa è la parte più difficile della procedura e richiede una notevole quantità di mani su esperienza di padroneggiare (dell'ordine di 5-20 ore a seconda del ricercatore). La punta dell'ago è evidente nell'immagine ultrasuoni come il punto più chiaro sullo schermo, e dovrebbe essere visto in movimento in conformità con le regolazioni della posizione della sonda (utilizzando i controlli motorizzati nelle y z e aerei, e il controllo manuale della x piano). E 'estremamente importante che la direzione di oscillazione della sonda essere parallela alla lunghezza dell'ago. Ciò assicurerà che la punta dell'ago rimane nel piano dell'immagine durante i movimenti di posizione che per l'iniezione in embrione.
2. L'embrione deve essere posizionato in modo tale che la regione di destinazione (in questo caso il ventricolo proencefalo) è facilmente visibile e accessibile a l'ago con la minor quantità di materiale uterina nel percorso di iniezione. Inoltre, è fondamentale non iniettare attraverso la placenta. Una volta che la regione del cervello target è allineato con la direzione di avanzamento ago (con la manopola sul micromanipolatore), l'ago deve essere sfiora la parete uterina, e poi un colpo corto veloce in avanti dovrebbe penetrare il tessuto. Un approccio simile è utilizzato per penetrare il sacco amniotico e poi il cervello. In alcuni casi, ricercatore ed esperto in grado di colpire il ventricolo in un unico movimento, soprattutto se l'ago è molto forte. La meccanica del movimento della sonda, l'ago, e gli embrioni (spostando la madre sul palco), richiedono hands-on di pratica per padroneggiare.
3. Una volta che il numero desiderato di embrioni è stato iniettato, in prossimità della parete addominale con 5,0 punti di sutura di seta. La meccanica di sutura non sono specifici per questo tipo di chirurgia. Infine, l'uso autoclips veterinaria di base della pelle assieme sui punti nei muscoli addominali. Sutura la pelle non è raccomandato perché il mouse masticare fuori i punti. Analgesia deve essere applicato alla zona di incisione per ridurre la quantità di dolore provato con il mouse come lo risveglia. Si consiglia una soluzione bupivacaina 0,25% da iniettare (0,8 ml / kg, o 2 mg / kg) per via sottocutanea ogni pochi millimetri lungo il sito di incisione.
4. Mentre il mouse recupera appoggiare delicatamente l'animale su carta assorbente in una gabbia pulita contenente una confezione di gel (per facilitare l'alimentazione e idratazione). Posizionare la gabbia su un set di diapositive più calda a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea. Quando si risveglia, posizionare il mouse e la confezione di gel in una gabbia pulita e tornare al rack animale.
5. Il giorno successivo controllare il mouse di qualsiasi sanguinamento vaginale, contrazioni addominali, e / o uno sguardo d'insieme in difficoltà, che indicano l'aborto. Se questo è il caso, l'eutanasia il mouse immediatamente. Capelli ben curati e un aspetto sano generale indicano recupero di successo da un intervento chirurgico. Gli embrioni iniettato può essere sacrificato embrionalmente o dopo la nascita per ulteriori analisi. Se il virus esprime un gene reporter, come la fosfatasi alcalina umana (PLAP) o GFP, una colorazione rivelerà zone di positivo infezione virale (Figure1C).

Rappresentante Risultati

Embrioni iniettato può essere sacrificato 1-2 giorni dopo l'iniezione fino in fondo fino all'età adulta. Se il virus esprime un gene reporter, come PLAP o GFP, allora espressione giornalista serve per identificare le cellule infettate virale e cloni di quelle cellule. Per esempio, mostrato nella Figura 1C è una sezione di tessuto di un cervello post-natale che è stato infettato in utero a E9.5 con un vettore retrovirale PLAP esprimere. Cellule infette vengono visualizzati come grappoli viola dopo la colorazione istochimica. Oltre a identificare le cellule infettate virale, espressione giornalista permette di esaminare la morfologia cellulare e la posizione, così come lo stato di espressione genica.

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Figura 1. Iniezione virale nel topo E9.5 ventricoli proencefalo. A. L'animale anestetizzato è posta sulla fase di iniezione. Due embrioni sarebbe esposto e posizionato sotto la sonda ecografica dove indicato (freccia). L'ago microiniezione pieno di virus si trova vicino al embrioni e allineati con la sonda ad ultrasuoni. Schermo B. cattura di un immagine in tempo reale ad ultrasuoni da un embrione di topo E9.5. V, ventricolo, AS, sacco amniotico; UW, parete uterina. Embrioni C. è stato iniettato un virus PLAP che esprimono a 10,5. Colorazione istochimica per PLAP rivela la posizione degli eventi infezione virale.

Discussion

Iniezioni virale con guida ecografica può essere condotta da E8.5-E11.5, dove solo il sacco amniotico può essere iniettato a E8.5, mentre sia il sacco amniotico e il sistema ventricolare può essere iniettato da E9.5-E11.5. Quando eseguito correttamente, particelle virali iniettato nel sistema ventricolare sotto controllo ecografico ha accesso alle cellule che rivestono il sistema ventricolare e, quindi, può infettare le varie strutture della (neocorteccia, gangli basali, diencefalo, occhio, ecc) proencefalo, mesencefalo , e romboencefalo (Figure1C). Virus iniettato nel sacco amniotico ha accesso alle celle sulla parte esterna dell'embrione. Oltre a virus, guida ecografica può essere utilizzato anche per iniettare le cellule in un embrione di sviluppo. Pertanto, questa tecnica offre molteplici opzioni tra cui scegliere (periodo di sviluppo, la struttura, virus / cellule) durante la progettazione di un esperimento.

E 'fondamentale che il virus iniettato o cellule esprimono un reporter per una facile identificazione delle cellule infette / iniettato. Storicamente, umano fosfatasi alcalina placentare (PLAP) o GFP sono stati utilizzati. Per esperienza, abbiamo trovato PLAP può essere un gene reporter molto utile perché sia ​​PLAP istochimica e immunoistochimica produce una cellula netta e distinta singola macchia che permette di analizzare la morfologia delle cellule e la posizione, e per realizzare una analisi clonale. Dal momento che l'espressione GFP virale può essere debole, un reporter GFP può non essere ideale per la colorazione dei tessuti, ma è utile se si vuole ottenere singole cellule ordinando fluorescenza delle cellule attivate (FACS).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micromanipulator	Narishige International	91084361683D
HI-7 pipette holder	Narishige International	9108436141
10 mm support arm	Carl Zeiss, Inc.	9108436206
IP iron base plate	Carl Zeiss, Inc.	9108436167
CI-1 connector for pipette holder	Carl Zeiss, Inc.	9108436257
1mm ID tubing	Carl Zeiss, Inc.	911013
3-way luer lock stopcock (pkg 10)	Carl Zeiss, Inc.	K420163-4503
Motor controller, 2-4 axes	Newport Corp.	860-c2
Joystick	Newport Corp.	PMC200-J
Micrometer adapter	Newport Corp.	ADAPT-BM17-375
Motorized drive	Newport Corp.	CMA-25CC
Cable assembly	Newport Corp.	860I-10
25 mm translation stage	Newport Corp.	UMR8-25
Micrometer	Newport Corp.	BM17-25
Base plate	Newport Corp.	M-PBN8
Inner mounting bracket	Newport Corp.	EQ80-I
Outer mounting bracket	Newport Corp.	EQ80-E
Man. infusion/withdrawl pump	Stoelting Co.	51222
25 μl microsyringe	Stoelting Co.	51113
24"x12"x0.5" metric board plate	Edmund Scientific	NT03-640
Set of self-adjusting feet	Edmund Scientific	NT34-841
Bar-type lens holder	Edmund Scientific	NT03-669
Right angle post clamp	Edmund Scientific	NT53-357
2" post holder	Edmund Scientific	NT03-646
4” steel post	Edmund Scientific	NT36-499
6” steel post	Edmund Scientific	NT36-503
12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2"	Edmund Scientific	NT03-644
PBS, pH7.4	Invitrogen	10010049
Slide warmer	Fisher Scientific	Numerous options
Double Edge Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm	Sutter Instrument Co.	B100-50-10
1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8	BD Biosciences	329412
Autoclip Applier	BD Biosciences	427630
Autoclips, 9mm (to close skin incision)	BD Biosciences	427631
5.0 Silk sutures	Fisher Scientific	S-1173
Sterilube ophthalmic ointment	Fera pharmaceuticals	48102-012-35
MB-10 or equivalent disinfectant	Quip labs
10% bleach	Multiple Suppliers
"One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging. P60 Ultrasound BioMicroscope (UBM) from Paradigm-Medical (http://www.paradigm-medical.com/ubms.html). Vevo 2100 from VisualSonics (http://www.visualsonics.com/) Anesthetic and Analgesic The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain. The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical.