Summary
En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.
Abstract
En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. Sin embargo, debido a que la pared uterina es opaco durante la embriogénesis temprana, la capacidad de dirigirse a partes específicas del embrión para la microinyección es muy limitada. Afortunadamente, la alta frecuencia de imágenes por ultrasonido permite la generación de imágenes que se pueden utilizar en tiempo real para guiar una aguja de microinyección de embriones en la región de interés. A continuación se describe el uso de imágenes como para guiar la inyección de vectores retrovirales en el sistema ventricular del cerebro anterior del ratón en el día embrionario (E) 9.5. Este método utiliza una laparotomía para permitir el acceso a los cuernos uterinos, y una placa especialmente diseñada que permite a los embriones de host que se bañaba en una solución salina mientras se crean imágenes y se inyecta. Cirugías exitosas a menudo resultan en la mayoría o la totalidad de los embriones inyectados sobrevivir a cualquier punto de tiempo posterior de interés (embrionaria o post-parto). Los principios descritos aquí se pueden utilizar con ligeras modificaciones para realizar las inyecciones en el fluido amniótico de embriones E8.5 (permitiendo así la infección a lo largo de la extensión antero-posterior del tubo neural, que aún no ha cerrado), o en el sistema ventricular del cerebro en E10.5/11.5. Además, a mediados de los años neurogénica (~ E13.5), la ecografía se puede utilizar la inyección directa en regiones específicas del cerebro de una infección viral o el trasplante de células. El uso de la ecografía para guiar en las inyecciones de útero en ratones es una técnica muy poderosa que permite la manipulación molecular y celular de los embriones de ratón de manera que de otra forma sería sumamente difícil si no imposible.
Protocol
Parte 1. Prepare el área quirúrgica
- Si se trabaja con reactivos de riesgo biológico (por ejemplo, los vectores retrovirales), la cirugía debe ser realizada dentro de un gabinete de bioseguridad II (BSC). El microscopio de retrodispersión ultrasonido (UBM) debe sentarse al lado de la BSC, con el transductor en el interior del BSC, y en su lugar por un soporte de motor controlado en un escenario especialmente diseñado quirúrgica. Los componentes necesarios para construir el escenario se muestra en el video se muestran en línea. Esta lista, junto con imágenes de la etapa desde varios ángulos (a petición), en caso de permiso de construcción.
- La apertura y cierre de la laparotomía (procedimiento quirúrgico en el que se corta la cavidad abdominal abierta para permitir el acceso a los órganos internos) se realiza generalmente en una almohadilla absorbente con soporte de plástico. Antes de la cirugía todas las herramientas necesarias (por ejemplo, navajas, tijeras quirúrgicas, pinzas, cargado autoclip aplicador, etc) y materiales (por ejemplo, PBS, suturas, anestésicos, el titular del ratón y placa superior, etc) deben ser esterilizados y colocados en el área quirúrgica. Limitar la cantidad de tiempo que la incisión se abra es importante para maximizar las posibilidades de éxito con la cirugía. Todo el manejo de los animales debe realizarse con guantes que han sido desinfectados con una solución MB-10, o su equivalente. Desinfección repetida se debe realizar cuando sea necesario para asegurar que los guantes estériles.
Parte 2. Anestesia del ratón
- Llene una jeringa de 1 cc con la solución anestésica que contiene una parte Nembutal (50 mg / ml de pentobarbital) a 4 partes filtrada esterilizada 25 mg / ml sulfato de magnesio en PBS. Esto dará como resultado una solución que es de 10 mg / ml de pentobarbital y 20 mg / ml de sulfato de magnesio. Cada ratón para pesar cada sujeto, y se inyecta con 90 mg de pentobarbital por kg de peso corporal (por ejemplo, un ratón de 28 g se inyecta con 250 l).
- Se inyecta en el abdomen (intraperitoneal IP,) de un ratón embarazadas en el día embrionario (E) 9.5 (puede utilizar otras edades, según sea necesario) que penetra la piel y los músculos abdominales. Permitir 8-12 minutos para que el ratón deje de responder. Anestesia adecuada debe ser confirmado por la postura relajada del animal, y la falta de movimiento en respuesta a la cola y aprieta el dedo del pie. Pellizcando suavemente entre las uñas de los dedos es muy sensible, y la falta de respuesta a los pellizcos ponga de manifiesto que los animales es lo suficientemente anestesiado. Tenga en cuenta incluso los animales que son completamente insensibles a pellizca la cola y los pies puede a veces un poco nerviosa en respuesta a la incisión quirúrgica inicial. Sin embargo, esta es una respuesta refleja y no indica una anestesia inadecuada. A base de petróleo bálsamo oftálmica se debe aplicar a los ojos del ratón para evitar que se seque durante la cirugía.
- Puesta en marcha del área quirúrgica y la máquina de ultrasonido a la espera de convertirse en el ratón anestesiado. Dado que el uso de retrovirus o lentivirus requiere BSL2 de contención, como se ha dicho que las inyecciones virales se debe realizar en un gabinete de bioseguridad II. Además, todas las soluciones y los materiales desechables que entra en contacto con el virus, deben ser descontaminadas con una solución de lejía al 10%. Los instrumentos quirúrgicos y equipos de ultrasonido deben ser tratados con una solución desinfectante, como MB-10 ( http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), o su equivalente utilizada por la instalación en cuestión.
Parte 3. La exposición de los embriones
- Si es posible (dependiendo de las limitaciones de las instalaciones de animales y dado el espacio disponible), es preferible que el área de preparación quirúrgica en un lugar separado de la zona quirúrgica. Esto minimizará las posibilidades de contaminación cruzada entre animales. Para iniciar la cirugía, el lugar del animal sobre su espalda en una superficie absorbente estéril y lavar la zona abdominal a fondo con etanol al 70%. Tratamientos pre-quirúrgica más extensa puede ser empleado (por ejemplo, las rondas sucesivas de Betadine y el 70% se lava etanol), pero en nuestra experiencia esto no es necesario para este tipo de cirugía de roedores supervivencia. Usando una maquinilla de afeitar de doble filo, afeitar el vello del abdomen en un área de aproximadamente 1 pulgada de ancho y largo de 1,5 pulgadas. Use movimientos cortos de rápido con la navaja en un ángulo de aproximadamente 45 °. Es importante que el área quirúrgica adecuadamente tratadas, pero no sometido a la humedad excesiva, ya que esto puede dar como resultado escalofriante innecesario del animal, y, posiblemente, la hipotermia.
- Usando tijeras quirúrgicas bien hacer una una "incisión longitudinal a través de la piel, y luego a través del músculo abdominal del animal (corte a través de la celebración de tejido conectivo de la piel al músculo le ayudará con la segunda incisión). Tenga en cuenta que toda la atención procedimiento debe Es necesario asegurarse de que los instrumentos quirúrgicos siguen siendo estéril, y el tratamiento con desinfectante se debe realizar cuando sea necesario (es decir, si la información sobre herramientas en contacto con no-sterile material).
- Utilizando unas pinzas con cuidado sacar cuernos uterinos, y registrar el número de embriones a cada lado. Dejando dos embriones adyacentes expuestos (selección de los cuales dos dependen de la configuración de cada lado), el lugar más de los cuernos uterinos de nuevo en el animal. En este contexto, dos embriones serán expuestos en un momento dado y se bañó en PBS, mientras que la madre se quede en su espalda.
- Colocar el animal sobre su espalda en el soporte de plexiglás donde estará durante la cirugía (Figure1A) *. Luego, baje el tejido 10cm placa de cultivo ** (que deben ser desinfectados con MB-10 antes de su uso) hacia abajo sobre la madre, con un par de pinzas de colocarse ligeramente a través de la membrana de silastic verde (hecha con silicona RTV L base de goma, y el agente de curado, Dow-Corning números 3142761 y 2156946 del producto, respectivamente). A medida que baja el plato sobre el animal, el uso del fórceps para sujetar el tejido uterino entre los dos embriones que se inyecta, y suavemente tirar de ellos a través de la membrana. Al mismo tiempo, la placa se reduce completamente hacia abajo en el soporte, y las tachuelas son empujados para mantenerlo en su lugar. Pre-caliente (a 37 ° C) PBS se añade al plato para cubrir completamente los embriones.
- Lugar la fase de inyección que contenga los animales y embriones expuestos en la sonda de ultrasonido (Figure1A) para crear imágenes en tiempo real de los embriones expuestos a través de la pared uterina (Figure1B). La sonda se baja entonces (usando los controles del motor) en el baño de PBS directamente sobre los embriones para obtener imágenes. Las imágenes se pueden obtener cuando la sonda es de aproximadamente 2.3 mm de distancia de los embriones. Es muy importante asegurarse de que la cabeza de la sonda no toque los embriones, ya que oscila de un lado a otro para recoger las imágenes.
* El titular de la madre descansa en durante la cirugía puede ser realizada por un taller mecánico. Debe incluir una base de metacrilato de ancho, con dos lados de plexiglás pegado en la parte superior, y un espacio entre ellas (lo suficientemente amplia como para el ratón de forma mientras está acostado boca arriba). Las partes deben tener un suelo del valle de ellos, que se rellena con cera de color negro (por ejemplo, de una bandeja de disección). Que la cera sirve como el material en que se presiona chinchetas para sujetar la placa de PBS que los embriones se bañan en durante la inyección.
** Platos de 10 cm bacteriana debe tener un agujero (aproximadamente 2 cm de diámetro) golpeó fuera del centro de la parte inferior (esto se puede hacer con un portátil de trabajo pesado Punch y de 13/16 º matriz circular pulgadas: http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). Además, dos pequeños agujeros a cada lado del orificio central (alrededor de 1,5 cm de distancia) se debe quemar con una aguja calentada al fuego (o pueden ser hechos con un taladro, por supuesto). Estos agujeros son cubiertas con grasa de vacío y será donde las chinchetas que sujetan la placa en el soporte de impulsar en la cera color negro. La grasa de vacío para evitar que el PBS se escape.
Parte 4. Carga de virus en una aguja de microinyección
- Moda de una aguja de microinyección de un chaflán de 1 mm (diámetro interior) sacó capilar de vidrio. La nitidez de la aguja es fundamental, y trabajar con una aguja lo suficientemente fuerte puede comprometer seriamente la penetración de la pared del útero y el saco amniótico, y puede conducir al fracaso experimental. La aguja afilada se coloca en el soporte de la pipeta, que está conectado mediante un tubo a una microjeringa de 25 l montado en un manual de infusión / extracción de la bomba (otros dispositivos se pueden utilizar para regular la carga y descarga de la aguja, pero esto es lo que se muestra en el video). Para obtener la respuesta óptima (para evitar la expansión y compresión asociadas con un sistema de llenado de aire), la microjeringa, el tubo y la aguja debe estar lleno de aceite mineral.
- Antes de cargar la aguja asegurarse de que no haya burbujas de aire en el sistema de la jeringa hasta llegar a la punta de la aguja. A continuación, retroceder un pequeña burbuja de aire (1-2 mm de longitud) en la aguja antes de comenzar a cargar el virus. Esta bolsa de aire ayuda a mantener la separación entre el virus y el aceite mineral. La acción viral para ser inyectada debe contener polibreno a una concentración final de 0,08 mg / ml (para más información sobre la producción de virus, consulte las referencias 1, 2). Tenga en cuenta que concentran las poblaciones de antirretrovirales en general, contienen una cantidad significativa de partículas, que contiene la mayor parte del material infeccioso, por lo que no se puede filtrar a cabo sin un cinco - a la caída de 10 veces en el título. Además, dependiendo de la preparación, la acción viral puede ser viscoso a partir del ADN genómico de las células lisadas de embalaje (especialmente cierto si se utiliza 293 células para generar MLV / VSV virus pseudotyped). Si la alícuota del virus es viscoso, una pequeña cantidad de DNasa I puede y debe ser añadido para aflojar las acciones, o la carga de la aguja será extremadamente difícil. A gota de la acción viral (80-10 l) se debe colocar en una hoja estéril de parafina en la preparación para la carga de la aguja. Luego, utilizando la bomba de la retirada, con cuidado la carga de la atención de la aguja para evitar pagar los zuecos. Coloque la aguja con peso en la posición micromanipulador en la zona de inyección, teniendo cuidado de no romper la aguja en los embriones, o la sonda de ultrasonido. Tenga en cuenta que si por alguna razón que la aguja se carga mucho antes de la inyección que ha de ocurrir que puede ser útil para extraer una pequeña cantidad de aire en la punta, que puede ser dado de alta antes de comenzar las inyecciones. Esta bolsa de aire puede proteger contra la acción viral de secado en la punta de la aguja (un hecho que casi siempre hacen que la aguja con peso inútil).
Parte 5. El ultrasonido de inyección viral guiadas
- La imagen en tiempo real creado por la sonda de ultrasonido se visualiza en el monitor de vídeo, y pueden ser utilizados para guiar la aguja de microinyección en el embrión. El uso de este sistema de virus pueden ser inyectados en el saco amniótico en E8.5 o bien el saco amniótico o el sistema ventricular de E9.5-E11.5 (Figure1B). Esta es la parte más difícil del procedimiento y requiere una cantidad significativa de las manos en la experiencia de maestros (del orden de 50-20 horas, dependiendo del investigador). La punta de la aguja es evidente en la imagen de la ecografía como el punto más brillante en la pantalla, y debe ser visto en movimiento, de acuerdo con los ajustes de la posición de la sonda (utilizando los controles del motor y en los aviones y la z, y el control manual de la x avión). Es muy importante que la dirección de oscilación de la sonda será paralela a la longitud de la aguja. Esto asegurará que la punta de la aguja permanece en el plano de la imagen en movimiento a la posición de la inyección en el embrión.
- El embrión debe ser posicionado de tal manera que la región de destino (en este caso el ventrículo del cerebro anterior) es fácilmente visible y se puede acceder a la aguja con la menor cantidad de material de útero en el camino de la inyección. Además, es muy importante no inyectar a través de la placenta. Una vez que la región del cerebro objetivo está alineado con la dirección de avance de aguja (usando la perilla en el micromanipulador), la aguja debe ser sólo tocar la pared uterina, y luego un golpe rápido corto primero debe penetrar en el tejido. Un enfoque similar se utiliza para penetrar en el saco amniótico y luego al cerebro. En algunos casos, el investigador y con experiencia puede golpear el ventrículo en un solo movimiento, sobre todo si la aguja es muy fuerte. La mecánica del movimiento de la sonda, la aguja, y los embriones (moviendo la madre sobre el escenario), requieren experiencia práctica para dominar.
- Una vez que el número deseado de embriones se ha inyectado, cerca de la pared abdominal, con 5,0 puntos de seda. La mecánica de la sutura no son específicos para este tipo de cirugía. Finalmente, el uso autoclips veterinarios para la piel de primera necesidad a más de los puntos de sutura en el músculo abdominal. La sutura de la piel no es recomendable porque el ratón se regaña a los puntos de sutura. La analgesia se debe aplicar a la zona de la incisión para reducir la cantidad de dolor experimentado por el ratón, ya que despierta. Se recomienda que una solución de bupivacaína al 0,25% se inyecta (0,8 ml / kg, o de 2 mg / kg) por vía subcutánea cada pocos milímetros a lo largo del sitio de la incisión.
- Mientras que el ratón se recupera Ponga el animal en un papel absorbente en una jaula limpia que contenga un paquete de gel (para facilitar la alimentación e hidratación). Colocar la jaula en un conjunto de diapositivas caliente a 37 ° C para mantener la temperatura corporal. Cuando despertó, coloque el ratón y el paquete de gel en una jaula limpia y volver a la rejilla de los animales.
- Al día siguiente, el ratón para comprobar cualquier sangrado vaginal, las contracciones abdominales, y / o una mirada angustiada en general, todos los cuales indican el aborto. Si este es el caso, la eutanasia el ratón inmediatamente. El cabello bien peinado y un aspecto saludable en general indican una recuperación exitosa de la cirugía. Los embriones inyectados pueden ser sacrificados embrionaria o post-parto para su posterior análisis. Si el virus se expresa un gen, tales como la fosfatasa alcalina humana (PLAP) o GFP, una tinción a conocer rincones de la infección viral positivo (Figure1C).
Resultados representante
Embriones inyectados pueden ser sacrificados 1-2 días después de la inyección hasta el final a la edad adulta. Si el virus se expresa un gen, como PLAP o GFP, entonces reportero de la expresión sirve para identificar las células infectadas por virus y clones de las células. Por ejemplo, se muestra en la Figura 1C es una sección de tejido de un cerebro postnatal que fue infectado en el útero en E9.5 con un vector retroviral que expresan PLAP. Las células infectadas se visualizan como racimos púrpura después de la tinción histoquímica. Además de identificar las células infectadas por virus, reportero de la expresión permite examinar la morfología celular y la posición, así como el estado de la expresión génica.
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Figura 1. Inyección viral en los ventrículos del cerebro anterior E9.5 ratón. A. El animal anestesiado se coloca en el escenario de la inyección. Dos embriones se exponen y se coloca debajo de la sonda de ultrasonido que se indique (flecha). La aguja de microinyección lleno de virus se encuentra cerca de los embriones y se alinearon con la sonda de ultrasonido. B. captura de pantalla una imagen de ultrasonido en tiempo real de un embrión de ratón E9.5. V, en el ventrículo, AS, el saco amniótico, la Universidad de Washington, la pared uterina. C. Los embriones fueron inyectados con un virus que expresan PLAP en E10.5. Tinción histoquímica para PLAP revela la ubicación de los eventos de infección viral.
Discussion
Inyecciones virales con ayuda de ultrasonido se puede realizar a partir de E8.5-E11.5, donde sólo se puede inyectar en el saco amniótico en E8.5, mientras que tanto el saco amniótico y el sistema ventricular se puede inyectar de E9.5-E11.5. Cuando se realiza correctamente, las partículas virales se inyecta en el sistema ventricular con ayuda de ultrasonido tienen acceso a las células que recubren el sistema ventricular y, por tanto, pueden infectar a las diferentes estructuras del cerebro anterior (corteza cerebral, ganglios basales, diencéfalo, ojos, etc), el cerebro medio , y rombencéfalo (Figure1C). Virus se inyecta en el saco amniótico tiene acceso a las células en el exterior del embrión. Además de los virus, la guía del ultrasonido también se puede utilizar para inyectar las células en el embrión en desarrollo. Por lo tanto, esta técnica ofrece múltiples opciones para elegir (período de tiempo de desarrollo, estructura, virus / células) en el diseño de un experimento.
Es fundamental que el virus inyectado o células expresan un reportero para una fácil identificación de las células infectadas / inyectado. Históricamente, los humanos fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) o GFP se han utilizado. Por experiencia, hemos encontrado PLAP puede ser un gen muy útil debido a que ambos PLAP histoquímicas y tinción inmunohistoquímica produce una sola célula precisa y definida mancha que permite analizar la morfología celular y la posición, y para llevar a cabo un análisis clonal. Dado que la expresión de GFP viral puede ser débil, un reportero GFP puede no ser ideal para la tinción de los tejidos, pero es útil si se quiere obtener células individuales de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS).
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micromanipulator | Narishige International | 91084361683D | |
| HI-7 pipette holder | Narishige International | 9108436141 | |
| 10 mm support arm | Carl Zeiss, Inc. | 9108436206 | |
| IP iron base plate | Carl Zeiss, Inc. | 9108436167 | |
| CI-1 connector for pipette holder | Carl Zeiss, Inc. | 9108436257 | |
| 1mm ID tubing | Carl Zeiss, Inc. | 911013 | |
| 3-way luer lock stopcock (pkg 10) | Carl Zeiss, Inc. | K420163-4503 | |
| Motor controller, 2-4 axes | Newport Corp. | 860-c2 | |
| Joystick | Newport Corp. | PMC200-J | |
| Micrometer adapter | Newport Corp. | ADAPT-BM17-375 | |
| Motorized drive | Newport Corp. | CMA-25CC | |
| Cable assembly | Newport Corp. | 860I-10 | |
| 25 mm translation stage | Newport Corp. | UMR8-25 | |
| Micrometer | Newport Corp. | BM17-25 | |
| Base plate | Newport Corp. | M-PBN8 | |
| Inner mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-I | |
| Outer mounting bracket | Newport Corp. | EQ80-E | |
| Man. infusion/withdrawl pump | Stoelting Co. | 51222 | |
| 25 μl microsyringe | Stoelting Co. | 51113 | |
| 24"x12"x0.5" metric board plate | Edmund Scientific | NT03-640 | |
| Set of self-adjusting feet | Edmund Scientific | NT34-841 | |
| Bar-type lens holder | Edmund Scientific | NT03-669 | |
| Right angle post clamp | Edmund Scientific | NT53-357 | |
| 2" post holder | Edmund Scientific | NT03-646 | |
| 4” steel post | Edmund Scientific | NT36-499 | |
| 6” steel post | Edmund Scientific | NT36-503 | |
| 12/pk set screws, 1/4-20 x 1/2" | Edmund Scientific | NT03-644 | |
| PBS, pH7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Slide warmer | Fisher Scientific | Numerous options | |
| Double Edge Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Borosilicate Glass O.D: 1.0mm, I.D.: 0.05mm | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| 1cc Insulin Syringe U-100 27G5/8 | BD Biosciences | 329412 | |
| Autoclip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| Autoclips, 9mm (to close skin incision) | BD Biosciences | 427631 | |
| 5.0 Silk sutures | Fisher Scientific | S-1173 | |
| Sterilube ophthalmic ointment | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | |
| MB-10 or equivalent disinfectant | Quip labs | ||
| 10% bleach | Multiple Suppliers | ||
"One of the following ultrasound backscatter microscopes can be used for this procedure. Although in the video the P40 from Paradigm-Medical is used, the P40 is no longer commercially available, and has been replaced by the P60, which is similarly priced and can be used for the same application. The additional materials described for stage construction are for use with Paradigm-Medical device(s). The Vevo 2100 comes with equipment for small animal imaging.
Anesthetic and Analgesic The Nembutal solution (50 mg/mL injectable sodium pentobarbital; produced by Abbott laboratories) can be obtained from Bulter Schein Animal Health. Note that this is a schedule II controlled substance and requires a Drug Enforcement Agency (DEA) license to obtain. The Bupivacaine solution (0.25%; produced by Hospira, Inc, among others) can be obtained from a number of distributors, including Moore Medical. |
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References
- Yee, J. K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).
- Gaiano, N. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
