플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Summary

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

Abstract

독감 연구 그룹의 숫자로 노력은 인플루엔자 바이러스 역방향 유전학의 개발과 개선에 중요한되었습니다. 원래 1999 년에 설립

Protocol

1. 인플루엔자 바이러스 구조 transfection

인플루엔자 바이러스는 부정적 - 표류하는 RNA 싸여 바이러스의 Orthomyxoviridae 제품군에 속한다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 적어도 11 바이러스성 단백질 (그림 1) ⁴ 인코딩 부정 극성의 8 개의 RNA의 유전자로 구성되어 있습니다. 우리는 (8 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 세그먼트를 포함하는 ambisense의 plasmids (pDZ)를 사용하여 가장 일반적인 실험실 변형, 인플루엔자 A/PR/8/34 ⁵ 중 하나의 구조에서,이 보고서에서, 초점을 맞출 것이다 그림 2).

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조를 위해, 우리는 각각의 재조합 바이러스 당 3 독립 transfections을 권장합니다. 하나 이상의 재조합 바이러스의 구조를 시도하는 경우, 구조를 바이러스의 수에 accordantly 다음 단계를 수행 규모. 다음 transfection 및 감염 프로토콜은 6 - 잘 접시를 위해 설정됩니다. 프로토콜의 구조 표현은 그림 3에서 그림입니다.

1. OptiMEM - Lipofectamine 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 미디어 250 μl와 LPF2000 당 transfection 6-8 μl를 준비합니다. 실온 (RT)에서 50~10분에 대한 부화. 한편, 플라스미드 transfection 혼합물을 준비합니다.
2. 플라스미드 transfection 혼합물 : OptiMEM 미디어 50 μl의 플라스미드 transfection 칵테일을 준비합니다. 우리는 일반적으로 구조마다 각각의 플라스미드 인플루엔자 DNA 1 μg을 사용합니다. OptiMEM 미디어 50 μl를 포함하는 튜브에 1 pDZ plasmids의 μl (1 μg / μl에서) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, 그리고 NS를 추가합니다.
3. OptiMEM - LPF2000 - DNA 플라스미드 혼합 : 인플루엔자 DNA 플라스미드 transfection 혼합물 (단계 1.2)로 1.1 단계에서 250 μl를 추가합니다. RT에서 20~30분이 혼합물을 품어. 한편, transfection에 대한 293T 및 MDCK 세포의 suspensions을 준비합니다.
4. 293T/MDCK 공동 문화의 준비 : 시작하기 전에, 37에 PBS 1X, DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 미디어, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 트립신 혼합물을 가지고 ° C. 세포의 밀도가 80-90%의 합류에 transfection의 날이 될 것입니다. 보통 293T 및 MDCK 세포 중 하나가 합류 100mm 요리 중 하나가 합류 100mm 요리는 구출 10-12 사용할 수 있습니다. 우리는 잘 당 셀 250 μl를 사용하려고합니다. 두 셀 라인 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML의 총 resuspended 것입니다.
   • 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브의 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 10 ML 각 세포 라인을 resuspend. 당신은 MDCK 세포에 대한 293T 세포 하나 하나의 튜브 튜브를해야합니다.
   • DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 3 ML에있는 293T 세포를 Resuspend하고 resuspended 때, 그 세포를 resuspend하는 MD​​CK 세포에 3 ML을 제공합니다. 이것은 귀하의 공동 문화 사용할 수 293T 및 MDCK 세포의 혼합물을 제공합니다.
   • 물론 당 293T/MDCK 전지 (6월 10일에서 12일까지 - 음 웰스) 250 μl를 추가합니다.
5. 20-30분 RT 보육 (1.3 단계) 후 OptiMEM - LPF2000 - 독감 DNA 플라스미드 혼합하는 DMEM 10% FBS 1퍼센트 PS 1 ML를 추가합니다.
6. 293T/MDCK 세포의 250 μl (1.4 단계)와 우물에 1.3 ML (1.5 단계)을 추가합니다.
7. 37 부드럽게 6 잘 판을 흔들 배양기에서 (ON) 야간 transfection의 부화를하게 ° C와 5% CO _2.
8. 다음날, 약 16~24시간 포스트 transfection은 transfection 미디어를 변경하고 48 시간 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 안에 transfected 세포를 품어.
9. 미디어를 변경 48 시간 후 microcentrifuge 관에 transfected 세포의 표면에 뜨는를 전송합니다.
10. 1~2분, 13,000 RPM의 microcentrifuge의 조직 문화 뜨는을 원심 분리기.
11. 6 - 잘 접시 (전날 도금) 또는 단계를 1.10에서 centrifuged 조직 문화 supernatants 200 μl 10 일 된 닭 embryonated 달걀 신선한 MDCK 세포를 감염. 2-3 일동안은 37 세포 및 / 또는 계란 ° C를 품어.
    1. 10 일 된 닭 embryonated 계란의 감염 : 닭고기 embryonated 달걀을 감염 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다.
       1. 공기 색과 allantoic 캐비티 사이의 인터페이스를 보시려면 빛을 candling 상자를 사용하여 10 일간 된 달걀 양초. 인터페이스 테두리에 연필 마크를 확인하십시오.
       2. 5 ML의 주사기 바늘로 달걀 껍질에 구멍을합니다.
       3. 1 ML의 주사기를 통해 단계를 1.10에서 조직 문화 supernatants 200 μl 각 계란을 감염.
       4. 면봉을 사용하여 녹인 왁스와 달걀 껍질에 구멍을 커버.
       5. 2-3 일동안은 37οC에 감염된 알을 품어.
    2. 신선한 MDCK 세포의 감염 : 통과 전날 사전, 공동 문화 293T/MDCK에서 조직 문화 뜨는MDCK 세포와 정지 6 - 웰 플레이트 요리 다음날 80-90%의 합류에 도달합니다. 보통 합류 100mm 조직 문화 판은 6-8 우물로 분할 수 있습니다. 세포를 씻어 두 번, PBS 1X와 trypsinize 및 6 자 번호판을 준비합니다. 부드럽게 세포의 군복을 입은 배포를하기 위해 손으로 접시를 흔들. 문화 전지, ON, 37 ° C 배양기 5 % CO _2. 감염 전에 monolayer을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인, 다음, 감염 진행 :
       • PBS 1X 1 ML과 함께 두 번, 세포를 씻으십시오.
       • RT에서 1 시간 동안 centrifuged 조직 문화 supernatants의 200 μl로 감염. 세포가 건조시키지 마십시오. 6 잘 판 매 10 분 록.
       • 바이러스 흡수 1 시간 후, MDCK 세포에서 감염 미디어를 제거하고 TPCK - 트립신 1 μg / ML를 포함한 DMEM PS 0.3 % BA 1 % 2 ML를 추가합니다.
       • 48-72시간에서 통과 후, cytopathic 효과 (CPE)는 MDCK 감염된 세포의 관찰, transfection 효율과 바이러스 부하에 따라 것입니다. CPE는 성공적인 구조를 제안합니다. 그러나, HA 분석 (제 2)은 아직도 조직 문화 supernatants에서 바이러스의 존재를 확인하기 위해 수행되어야합니다.
12. 감염된 닭고기 embryonated 계란에서 수확 allantoic 액 : 감염된 계란에서 allantoic 유체를 수확하기 위해 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행됩니다. allantoic 유체의 약 8-12 ML 각 10 일간 된에 감염된 계란에서 수확 수 있습니다. 전에 allantoic 유체를 수확하기 위해, 4에서 2 시간 동안 닭 계란 (또는 ON) 부화 ° C는 닭 배아를 죽이고 혈액을 응고합니다.
    • 멸균 조건을 확립하기 위해 70 %의 에탄올과 eggshells 씻으십시오.
    • 스푼으로 감청하여 공기 구멍을 통해 조심스럽게, 계란을 엽니다. 포셉의 도움으로 깨진 달걀 껍질을 제거합니다.
    • 1 ML의 바늘로, 계란의 노른자를 한방울 흘리지 않고 all​​antoic 멤브레인를 제거합니다.
    • 당신이 allantoic 유체에 10 ML의 피펫을 가이드로 주걱으로 닭 배아를 안정화. 속보 또는 달걀 노른자의의를 수집하지 않고 얼음 양동이에 얼음에 15 ML의 원심 관에 가능한 한 많은 allantoic 유체로 수집합니다. 각각의 달걀에 대한 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하십시오.
    • 4 5 분 원심 분리기 ° C 및 신선한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 allantoic 유체 (pelleted 적혈구를 복용하지 않고) 전송.
    • 4 centrifuged allantoic 유체가 들어있는 튜브를 저장 ° C들은 hemagglutination (HA) 분석과 구조 바이러스의 존재에 대한 확인까지.

2. 재조합 독감 바이러스의 구조를 확인하는 HA 분석

Hemagglutination 분석 (HA)는 정기적으로 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 수확한 계란의 allantoic 유체의 구조 바이러스의 존재를 감지하는 데 사용됩니다. 또는, immunofluorescence assays (IFA)도 수행할 수 있습니다. 분석은 구조 바이러스의 존재를 식별되면, 바이러스는 플라크가 정화 및 바이러스의 유전자 구성이 RT - PCR 및 시퀀싱에 의해 확인됩니다되어야합니다.

MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 감염된 계란에서 allantoic 액체에서 바이러스의 존재는 macroscopically 닭고기의 HA (또는 다른 소스) 적혈구 (RBC)를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 바이러스의 부재가 잘 하단에 빨간색 펠릿 (그림 4)의 형성을 허용하면서 바이러스의 존재는 RBC의 hemagglutination을 유도. 인플루엔자 바이러스의 경우, 그것은 약 10 ³ -10 ⁴ 플라크 형성 단위 (PFU)이 HA 분석에 긍정적인 신호를 제공하는 데 필요한 것으로 생각되며 따라서 IFA가 확인하는 HA 분석과 병행하여 수행할 수 진정한 부정적인 결과. 이하 103-104 바이러스가이 기술을 감지할 수 있기 때문에 기본 백신 독감 항체와 IFA는 HA 분석보다 더 민감합니다. 그것은 IFA에서 긍정적인 HA - 아무것도 없습니다 supernatants 또는 allantoic 체액보다 수 있습니다. 이 경우 바이러스가 MDCK 세포 또는 달걀에서 다시 passaging으로 증폭한다. Allantoic 유체 및 / 또는 두 번째 통로에서 조직 문화 supernatants 이제 HA 분석에서 분명 긍정해야합니다.

HA의 assays은 V - 바닥 96 - 웰 플레이트에서 실시하고 있습니다. 부정적인 (예를 들어, PBS 1X)와 긍정적인 (조직 문화 supernatants 및 / 또는 독감 바이러스 감염에서 allantoic 액체) 컨트롤 샘플은 항상 그것을 확인할 수있는 HA 분석에 포함되어야합니다.

• V - 하단의 각 잘 96 - 웰 플레이트에 PBS 1X의 50 μl를 분배.
• 50 μl 추가감염된 최초의 잘하는 계란에서 MDCK 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 다음과 우물 2 배 직렬 dilutions합니다. 마지막 우물에서 추가 50 μl를 폐기하십시오.
• 0.5 % 각각 잘하는 -1.0 %의 닭 적혈구 (PBS 1X에서 준비) 50 μl를 추가합니다.
• 얼음 V - 하단 96 자 30-45분에 대한 번호판을 (빨간색 점이 부정적인 제어 PBS 샘플의 하단에서 볼 수 있습니다까지) 알을 품다. 로 그림 4에 표시된 결과를 읽고 interpretate.

3. 조직 문화 supernatants의 통로

HA의 분석에 부정적인 결과는 조직 문화 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체에서 바이러스되는 현재의 낮은 수준 낮은 transfection 효율의 결과 수 있습니다. 신선한 MDCK 및 / 또는 embryonated 계란에서 이러한 샘플 통로 감염증는 이전에 다음 섹션 1.11.2에 설명되어있는대로 수행됩니다 (그림 3에 표시된) 바이러스의 증폭을 허용합니다.

4. 대표 결과

성공적인 독감 바이러스의 구조는 긍정적인 HA 분석 (그림 4)의 존재에 의해 확인됩니다. 또한, 조직 문화 supernatants 또는 계란에서 allantoic 유체에 감염된 세포에서 CPE의 존재는 긍정적인 바이러스 구조를 제안합니다.

그림 1. 인플루엔자 바이러스 구조 : 인플루엔자 바이러스는 두 가지 바이러스 glycoproteins (HA, NA)와를 포함하는 지질 이중층에 둘러싸여 또한, 이온 채널 단백질, M2. HA는 sialic에 바인딩 산성 함유 수용체를 담당하는 바이러스 첨부 단백질입니다. NA 호스트 세포에서 바이러스의 릴리스에 대한 책임이 있습니다. 지질 이중층 밑에, virion 조립 및 신진 및 바이러스 ribonucleocapsids의 원자력 수출에 필요한 핵 수출 단백질 (NEP)의 역할을 안쪽 표면 봉투 매트릭스 단백질 1, M1, 구성된 단백질 층입니다. 바이러스의 핵심은 바이러스 핵 단백질, NP하여 encapsidated 8 단일 좌초 부정적인 RNA 바이러스의 유전자로 구성된, ribonucleoprotein (RNP) 복합 구성되어 있습니다. RNP 복합과 관련된 바이러스 RNA 의존 RNA 중합 효소 subunits PA, PB1, PB2하고 있습니다. 각각 RNA 세그먼트 NS와 PB1로 인코딩되지 않은 구조 단백질 NS1과 PB1 - F2는, virion 구조의 일부가되지 않습니다.

그림 2. 인플루엔자 바이러스 구조 plasmids : ambisense 플라스미드 pDZ에 복제된 8 개의 독감 바이러스 유전자가 표시됩니다. pCAGGs ⁷ 플라스미드 단백질 표현에서 파생된 플라스미드 pDZ ^6, 인간의 RNA 효소 나는 발기인과 부정적인 감각의 게놈의 RNA를 인코딩 마우스 터미네이터 순서와 양방향 플라스미드 벡터이며 반대 방향으로 난 연합 효소로 효소 II 전사 카세트 (닭고기 β - 굴지의 발기인 및 polyA)이 같은 바이러스 유전자에서 바이러스 단백질을 인코딩합니다. 각 바이러스 세그먼트의 cDNAs는 SAPI 제한 endonuclease 사이트 및 각 세그먼트 (바이러스 유전자의 끝에 블랙 박스)의 noncoding 영역을 포함하는 순방향 및 역방향 primers와 RT - PCR에 의해 생성됩니다. PCR 제품은 삽 - I와 소화 pDZ로 복제된 것입니다.

그림 3. 에이트 - 플라스미드 기반의 독감 구조 시스템 : 8 인플루엔자 바이러스의 유전자를 포함하는 pDZ의 plasmids가 공동 문화 (1 일) 293T - MDCK 세포에서 정지, 공동 transfected 있습니다. 스물 네 시간 FBS없이 포스트 transfection, 미디어지만 TPCK / 트립신을 포함 (제 2 일) 대체됩니다. 마흔 여덟 시간 미디어를 변경한 후, 조직 문화 뜨는은 수확과 MDCK 또는 10 일 된 embryonated 닭고기 달걀 (일 4) 감염하는 데 사용됩니다. 48-72시간 포스트 증폭, 계란에서 감염 MDCK 세포 또는 allantoic 유체의 조직 문화 supernatants는 HA (6 일)에서 수확 및 바이러스의 존재에 대한 assayed 있습니다. 어떤 바이러스가 감지되지 않으면, 같은 supernatants 및 / 또는 allantoic 유체는 신선한 MDCK 세포 및 / 또는 embryonated 계란에 다시 passaged 수 있습니다.

그림 4. 적혈구응집소 분석 (HA) : 바이러스 입자에 의해 RBC의 Hemagglutination은 macroscopically 볼 수 있으며, 조직 문화 supernatants 또는 / 및 allantoic 체액에서 바이러스 입자를 감지하는 기준이됩니다. HA 분석 바이러스는 전염성 아르 입자와 타락한과 세포를 감염시킬 수있는 더 이상의 입자 사이에 차별하지 않습니다 있지만, 분석은 샘플에서 바이러스의 존재의 좋은 지표입니다. A) 생물 학적 샘플에서 바이러스의 존재 (하단)의 부재는 (위) 접시의 바닥이나 부재, resp에서 RBC의 존재에 의해 결정됩니다ectively. B)없이 바이러스 감지 수준 (위) 또는 바이러스의 존재 (아래)과 HA 분석의 대표적인 결과가 표시됩니다.

Discussion

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 구조는 프로토콜이 정기적으로 실험실에서 수행되면 간단하고 간단하게,하지만 처음에 여러 일이 잘못 이동할 수 있습니다. 바이러스를 생성하는 좋은 플라스미드 준비를하기 위해 필수적인 그것을 것입니다. 세포 라인 (293T 및 MDCK)의 적절한 유지 관리는 성공적인 바이러스 구조를 위해 중요합니다. 전통적으로, 유전자 태그는 침묵 돌연변이 유발에 의해 플라스미드 인플루엔자 유전자 인코딩에 삽입됩니다. 이 침묵 돌연변이 (S) 및 예를 들어, 창조의 소개, 소설의 제한 효소 사이트는 효소 분해에 의해 야생 - 타입과 재조합 독감 바이러스를 구분하는 데 사용됩니다. 따라서, 재조합 바이러스를 정화 상패의 증폭 후, RT - PCR 및 시퀀싱 방법은 구출 바이러스의 특성을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 이러한 역방향 유전학 기술과 plasmids에서 재조합 독감 바이러스의 성공적인 구조의 개발은 바이러스의 생물에 대한 구체적인 질문에 대한 답변을하실 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.