Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Summary

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Abstract

Inspanningen van een aantal influenza onderzoeksgroepen zijn de spil in de ontwikkeling en verbetering van het influenza A virus reverse genetics. Oorspronkelijk opgericht in 1999

Protocol

1. Influenza virus te redden transfectie

Influenza A-virus behoort tot de familie van negatieve Orthomyxoviridae-stranded RNA-virussen met een envelop. De influenza A-virus genoom bestaat uit acht verschillende RNA-genen van negatieve polariteit die coderen, op zijn minst, 11 virale eiwitten (figuur 1) ^4. We zullen, focus in dit rapport, over de redding van een van de meest voorkomende laboratorium stam, influenza A/PR/8/34, ⁵ met behulp van ambisense plasmiden (PDZ) met de acht influenza A/PR/8/34 virale segmenten ( Figuur 2).

Voor de redding van recombinante influenza virussen van plasmide DNA, raden we aan drie onafhankelijke transfecties per elk recombinant virus. Als er meer dan een recombinant virus te redden is geprobeerd, overeenkomstig aan de schaal van de volgende stappen uit om het aantal virussen worden gered. De volgende transfectie en infectie-protocol is vastgesteld voor 6-well-platen. Een schematische weergave van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mengsel: Bereid 250 pi OptiMEM media en 6-8 pi LPF2000 per transfectie. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Ondertussen bereiden de plasmide transfectie mengsel.
2. Plasmide transfectie mengsel: Bereid het plasmide transfectie cocktail in 50 ul van OptiMEM media. We gebruiken meestal 1 ug van elk influenza DNA-plasmide per redden. Voeg 1 ui van de PDZ plasmiden (bij 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, en NS om een ​​buisje met 50 ul van OptiMEM media.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmide mengsel: Voeg 250 ul van stap 1.1 in de griep-DNA-plasmide transfectie-mengsel (stap 1.2). Incubeer dit mengsel gedurende 20-30 minuten bij RT. Ondertussen bereiden suspensies van 293T en MDCK cellen voor transfectie.
4. Voorbereiding van 293T/MDCK co-cultuur: Voordat u begint, de PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS media, en EDTA-trypsine mengsel te brengen tot 37 ° C. De dichtheid van de cellen moet worden op 80-90% confluentie de dag van de transfectie. Meestal kan een samenvloeiende 100 mm gerecht van 293T en een samenvloeiing 100 mm schaal van MDCK cellen die worden gebruikt voor 10-12 reddingen. We gaan tot 250 pi cellen per goed gebruiken. Beide cellijnen zullen worden gesuspendeerd in een totaal van 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS.
   • Zorgvuldig mengen elke cellijn in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 15 ml centrifugebuis. U heeft een buis voor 293T cellen en een buis voor MDCK cellen.
   • Resuspendeer de 293T-cellen in 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS en wanneer geresuspendeerd, de 3 ml leveren aan de MDCK cellen om die cellen mengen. Dit geeft je het mengsel van 293T en MDCK cellen worden gebruikt voor uw co-cultuur.
   • Voeg 250 ul van de 293T/MDCK cellen per well (10-12 6-well putten).
5. Na 20-30 minuten RT incubatie (stap 1.3), voeg 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS aan de OptiMEM-LPF2000-influenza-DNA-plasmide mengsel.
6. Voeg de 1,3 ml (stap 1.5) in de putten met de 250 pi 293T/MDCK cellen (stap 1.4).
7. Schud de 6-well-plaat en 's nachts laat de transfectie incubeer (ON) in de incubator bij 37 ° C en 5% CO _2.
8. De volgende dag, ongeveer 16-24 uur na transfectie, verandert u de transfectie media en incubeer de getransfecteerde cellen in DMEM 0,3% BA 1% PS met 1 ug / ml van TPCK-trypsine gedurende 48 uur.
9. Na 48 uur van het veranderen van de media, overdracht van de supernatans van de getransfecteerde cellen in een microcentrifugebuis.
10. Centrifugeer de weefselkweek supernatant in een microcentrifuge voor 1-2 minuten, 13000 rpm.
11. Infecteren verse MDCK cellen in 6-well platen (plated de dag ervoor) of 10-dagen-oude kip bevruchte eieren met 200 ul van gecentrifugeerd weefsel kweeksupernatanten vanaf stap 1.10. Incubeer de cellen en / of eieren bij 37 ° C gedurende 2-3 dagen.
    1. Infectie van de 10-dagen oude kippen bevruchte eieren: Alle procedures om kippen bevruchte eieren infecteren worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
       1. Kaarsen de 10-dagen-oude eieren met behulp van een licht-schouwing box om de interface tussen de luchtzak en de allantoïsholte te zien. Maak een potlood teken op de interface grens.
       2. Met een 5 ml injectienaald maken een gat in de eierschaal.
       3. Met een 1 ml spuit, besmetten elk ei met 200 ul van het weefsel kweeksupernatanten vanaf stap 1.10.
       4. Bedek het gat in de eischaal met gesmolten was met behulp van een wattenstaafje.
       5. Incubeer de besmette eieren op 37οC voor 2-3 dagen.
    2. Infectie van verse MDCK cellen: De dag voor passage van de weefselkweek supernatant uit de 293T/MDCK co-culturen, prePare 6-wells plaat gerechten met MDCK-cellen tot 80-90% confluentie bereiken de volgende dag. Meestal kan een confluente 100 mm weefselkweek plaat op te splitsen in 6-8 putten. Was de cellen, tweemaal met PBS 1X, trypsinize en de voorbereiding van de 6-well platen. Schud de hand van de platen om een ​​geüniformeerde verdeling van de cellen. Cultuur van de cellen, ON, in de 37 ° C incubator, 5% CO _2. Voor infectie, controleer dan de cellen onder de microscoop om een ​​monolaag te bevestigen, vandaar verder met de infectie:
       • Was de cellen, twee keer, met 1 ml PBS 1X.
       • Infecteren met de 200 ul van gecentrifugeerd weefsel kweeksupernatanten gedurende 1 uur bij RT. Niet laten de cellen drogen. Rock de 6-well-plaat elke 10 minuten.
       • Na 1 uur van virale absorptie, verwijdert u de infectie media van de MDCK cellen en voeg 2 ml DMEM 0,3% BA 1% PS met 1 ug / ml van TPCK-trypsine.
       • Op 48-72 uur na de passage, afhankelijk van de transfectie-efficiëntie en het virus load, zal een cytopathogeen effect (CPE) worden waargenomen in de MDCK geïnfecteerde cellen. CPE suggereert een succesvolle redding. Toch moet een HA-assay (deel 2) nog steeds worden uitgevoerd om de aanwezigheid van het virus in het weefsel kweeksupernatanten te bevestigen.
12. Oogst allantoïsvocht van geïnfecteerde kippen bevruchte eieren: Alle procedures om de allantoïsvocht oogst van besmette eieren worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Ongeveer 8-12 ml van allantoïsvocht geoogst kan worden van iedere 10-dagen-oud-geïnfecteerde ei. Voorafgaand aan het oogsten van de allantoïsvocht, incubeer de kip eieren voor 2 uur (of ON) bij 4 ° C om de kip embryo te doden en stollen van het bloed.
    • Was de eierschalen met 70% ethanol tot steriele omstandigheden vast te stellen.
    • Open het ei, voorzichtig, via de ether holte door te tikken met een lepel. Verwijder de gebroken eierschaal met behulp van pincet.
    • Met een 1 ml naald, verwijder het allantoïs membraan zonder het breken van de eieren van de dooier.
    • Het stabiliseren van de kippenembryo met een spatel als je een 10 ml pipet gids in de allantoïsvocht. Verzamel zoveel allantoïsvocht mogelijk in een 15 ml centrifugebuis op ijs in een ijsemmer zonder te breken of het verzamelen van een van eigeel het ei's. Gebruik een 15 ml centrifugebuis voor elk ei.
    • Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C en breng de allantoïsvocht (zonder rekening te gepelleteerd rode bloedcellen), om een ​​frisse 15 ml centrifugebuizen.
    • Bewaar de buisjes met de gecentrifugeerd allantoïsvocht bij 4 ° C tot ze gecontroleerd op de aanwezigheid van geredde virus met een hemagglutinatie (HA) test.

2. HA-test aan de redding van recombinante influenza virussen te bevestigen

Hemagglutinatie assay (HA) wordt routinematig gebruikt om de aanwezigheid van geredde virus in MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of de allantoïsvocht geoogste eieren op te sporen. Als alternatief kunnen immunofluorescentie assays (IFA) ook worden uitgevoerd. Zodra een test geeft de aanwezigheid van geredde virus, moet het virus worden plaque gezuiverd en de genetische samenstelling van het virus zal bevestigd door RT-PCR en sequencing worden.

De aanwezigheid van het virus in de MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of in de allantoïsvocht van besmette eieren kan worden bepaald met behulp van macroscopisch HA van kip (of een andere bron) rode bloedcellen (RBC). De aanwezigheid van het virus induceert hemagglutinatie van RBC, terwijl de afwezigheid van het virus kan de vorming van een rode pellet in de bodem van de put (figuur 4). In het geval van influenza virus, wordt aangenomen dat ongeveer 10 ³ -10 ⁴ plaque-vormende eenheden (PFU) zijn verplicht om een positief signaal in de HA-test te geven, daarom een IFA kan worden uitgevoerd in parallel met de HA-test om te bevestigen een echte negatief resultaat. IFA met primaire anti-influenza-antilichamen is gevoeliger dan de HA-test, omdat minder dan 103-104 virussen kunnen worden gedetecteerd met deze techniek. Het is mogelijk dan supernatant of allantoïsvocht die HA-negatief zijn positief door de IFA. In dit geval moet het virus worden versterkt door passage, opnieuw, in MDCK cellen of in eieren. Allantoïsvocht en / of weefsel kweeksupernatanten van de tweede passage moet nu duidelijk positief zijn in de HA-test.

HA testen worden uitgevoerd in V-bodem 96-wells platen. Negatief (bijvoorbeeld PBS 1X) en positieve (weefselkweek supernatant en / of allantoïsvocht van een influenza virus infectie) controlemonsters moet altijd worden opgenomen in een HA-test te valideren.

• Doseer 50 pi PBS 1X in elk putje van de V-bodem 96-well plaat.
• Voeg 50 pide MDCK weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht van de besmette eieren naar de eerste put en maken twee-voudige seriële verdunningen voor de volgende putten. Gooi de extra 50 ul van de laatste goed.
• Voeg 50 pi van 0,5% -1,0% kip rode bloedcellen (opgesteld in PBS 1X) aan elke well.
• Incubeer de V-bodem 96-well plaat voor 30-45 minuten (tot een rode stip zichtbaar is in de bodem van een negatieve controle PBS monster) op ijs. Lezen en interpreteren van de resultaten zoals aangegeven in figuur 4.

3. Passage van weefsel kweeksupernatanten

Een negatief resultaat in de HA-test kan een gevolg van een lage transfectie-efficiëntie met lage niveaus van het virus aanwezig in het weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht worden. Passage van deze monsters in verse MDCK en / of bevruchte eieren zal versterking van het virus (zoals aangegeven in figuur 3) Infecties worden uitgevoerd zoals eerder beschreven in paragraaf 1.11.2.

4. Representatieve resultaten

Succesvolle influenza virus te redden zal worden bevestigd door de aanwezigheid van een positieve HA assay (figuur 4). Daarnaast zal het bestaan ​​van de CPE in de cellen die besmet zijn met het weefsel kweeksupernatanten of met de allantoïsvocht van eieren suggereren een positieve virale te redden.

Figuur 1. Influenza Virus structuur: Influenza virus is omgeven door een lipide bilaag met de twee virale glycoproteïnen (HA, NA) en, ook, het ionkanaal eiwit, M2. HA is de virale bijlage eiwit, verantwoordelijk voor de binding aan siaalzuur-bevattende receptoren. NA is verantwoordelijk voor de virale vrijlating uit de gastheercellen. Onder de lipide bilaag, is een eiwit laag bestaat uit de binnenzijde envelop matrix eiwit 1, M1, die een rol speelt in virion montage en ontluikende en de nucleaire export eiwit (NEP), die nodig zijn voor de nucleaire export van virale ribonucleocapsids. De kern van het virus is gemaakt van een ribonucleoproteïne (RNP) complex, bestaande uit 8 enkelstrengs RNA-negatieve virale genen encapsidated door het virale nucleoproteïne, NP. Worden geassocieerd met het RNP complex zijn de virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase subeenheden PA, PB1, en PB2. De niet-structurele eiwitten NS1 en PB1-F2, gecodeerd door het RNA segmenten NS en PB1, respectievelijk, maken geen deel uit van het virion structuur.

Figuur 2. Influenzavirus rescue plasmiden: De acht influenza virus genen gekloneerd in de ambisense plasmide PDZ worden aangegeven. PDZ plasmide ^6, afgeleid van het proteïne-expressie-plasmide pCAGGs ^7, is een bidirectionele plasmide vector met een menselijk RNA polymerase I promotor en een muis terminator-sequentie die de negatieve zin genomische RNA codeert, in tegenovergestelde richting van de polymerase I te verenigen, een polymerase II transcriptie cassette (kip β-actine-promotor en polyA) codeert voor de virale eiwitten uit dezelfde virale gen. cDNA's van elk virale segment worden gegenereerd door RT-PCR met voorwaartse en omgekeerde primers die de Sapi restrictie endonuclease site en het niet-coderende regio's van elk segment (zwarte dozen aan het eind van de virale genen). Het PCR-product is gekloneerd in de PDZ gedigereerd met Sap-I.

Figuur 3. Acht-plasmide-gebaseerde influenza rescue-systeem: PDZ plasmiden die de 8 influenza virale genen zijn co-getransfecteerd, in suspensie, in 293T-cellen MDCK co-culturen (dag 1). Vierentwintig uur na transfectie, media zonder FBS maar met TPCK / trypsine is vervangen (dag 2). Achtenveertig uur na het veranderen van media, is weefselkweek supernatant geoogst en gebruikt voor het MDCK of 10-dagen oude bevruchte kippeneieren (dag 4) besmetten. 48-72 uur post-versterking, weefselkweek supernatanten van MDCK geïnfecteerde cellen of allantoïsvocht van eieren worden geoogst en onderzocht op aanwezigheid van virus door HA (dag 6). Als er geen virus wordt gedetecteerd, kan dezelfde supernatant en / of allantoïsvocht opnieuw worden gepasseerd in de frisse MDCK cellen en / of bevruchte eieren.

Figuur 4. Hemagglutinine assay (HA): hemagglutinatie van RBC door een virus deeltje is zichtbaar macroscopisch en is de basis voor virale deeltjes te detecteren in weefsel kweeksupernatanten en / of allantoïsvocht. Hoewel de HA-test maakt geen onderscheid tussen virale deeltjes die zijn besmettelijk en deeltjes die worden afgebroken en niet meer in staat om cellen te infecteren, de test is een goede indicator van de aanwezigheid van virus in monsters. A) Ontbreken (boven) van de aanwezigheid (onderkant) van het virus in de biologische monsters wordt bepaald door de aanwezigheid van RBC in de bodem van de plaat of de afwezigheid daarvan, respectief. B) Een vertegenwoordiger het gevolg zijn van een HA-test met geen detecteerbare niveaus van het virus (boven) of aanwezigheid (onderkant) van het virus is aangetoond.

Discussion

Redding van recombinant influenza virussen uit het plasmide DNA is een eenvoudig en duidelijk proces zodra het protocol routinematig wordt uitgevoerd in het laboratorium, maar in het begin, meerdere dingen mis kan gaan. Het is noodzakelijk om een ​​goede voorbereiding plasmide hebben om het virus te genereren. Goed onderhoud van de cellijnen (293T en MDCK) is cruciaal voor een succesvolle viral te redden. Traditioneel wordt een genetische tag ingevoegd in een influenza gen-codering plasmide, door stille mutagenese. Introductie van deze stille mutatie (s) en de oprichting van, bijvoorbeeld, is een nieuwe restrictie-enzym site gebruikt om onderscheid te maken tussen de wild-type en recombinant influenza virus door enzymdigestie. Daarom, na amplificatie van de plaque gezuiverde recombinante virus, moet RT-PCR en sequencing methoden worden uitgevoerd om de aard van de geredde virus te verifiëren. De ontwikkeling van deze reverse genetics technieken en succesvolle redding van recombinant influenza virussen van plasmiden kunt u specifieke vragen over de biologie van het virus te beantwoorden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.