Summary
Protocol
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस रिएक्शन
70-80 हीटिंग ब्लॉक मुड़ें डिग्री सेल्सियस और 42 डिग्री सेल्सियस जल स्नान भी इस चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि हीटिंग ब्लॉकों का उपयोग, कुछ पानी इतना डाल दिया है कि गर्मी के समान है.
- भड़काना प्रतिक्रिया
- शाही सेना के 3 μg ले लो
- RNase मुफ्त पानी के साथ 13 μl मात्रा समायोजित
- यादृच्छिक hexamer प्राइमरों (2mg/mL) के 2.5 μl जोड़ें
- अच्छी तरह मिक्स और 70-80 ° सी में 8 मिनट के लिए सेते हैं. फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
- आरटी कॉकटेल (14.5 μl / rxn) तैयार:
घटक आयतन 5X पहले Strand बफर 6 μl 0.1 एम डीटीटी 3 μl 25x मिश्रण aminoallyl - dNTP 1.2 μl सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय आरटी (200U/μl) 2.3 μl पानी 2.0 μl
* N प्रतिक्रियाओं के लिए, n कॉकटेल के 0.5 aliquots के लिए मास्टर मिक्स तैयार करने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि तुम बाहर नहीं चलेंगे. - ठंडा प्रतिक्रियाओं 14.5 μl जोड़ें.
- (भंवर नहीं है) मिक्स और 42 ° 3-4 घंटे के लिए सी में सेते
- नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता, यदि आवश्यक.
Hydrolyze शाही सेना
- प्रत्येक नमूना के लिए, 3 एन 1 NaOH μl और 0.5 एम EDTA के 0.6 μl जोड़ें. (अंतिम conc.s = 100mm NaOH, 10mm EDTA)
- मिश्रण और 65 में सेते ° C 10 मिनट के लिए.
- बेअसर 33.6 μl 1M HEPES जोड़कर, पीएच = 7.0 (सान्द्र अंतिम .= HEPES 500mm)
- नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, यदि आवश्यक.
रिएक्शन शोधन: आ dUTP अनिगमित हटाना और मुक्त amines
नोट: यह शुद्धि Qiagen QIAquick PCRpurification किट प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है. फॉस्फेट धोने और elution बफ़र्स Qiagen आपूर्ति buffers के लिए प्रतिस्थापित कर रहे हैं क्योंकि Qiagen बफ़र्स मुक्त amines है कि Cy डाई युग्मन प्रतिक्रिया के साथ प्रतिस्पर्धा होते हैं. मिनी प्रस्तुत करने किट से स्तंभ भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 300 (या 5X प्रतिक्रिया मात्रा = 336 μl) μl बफर पंजाब (Qiagen की आपूर्ति) के साथ सीडीएनए प्रतिक्रिया मिक्स और QIAquick स्तंभ को हस्तांतरण.
- 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्तंभ (Qiagen की आपूर्ति) प्लेस और ~~ 1 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. खाली संग्रह ट्यूब.
- धो करने के लिए, स्तंभ और ~~ 1 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र 750 μl फॉस्फेट धोने बफर (है Qiagen नहीं) में जोड़ें.
- संग्रह ट्यूब खाली और 750 μl धोने और centrifugation कदम दोहराने.
- संग्रह ट्यूब खाली और कॉलम अधिकतम गति पर एक अतिरिक्त 1 मिनट अपकेंद्रित्र.
- एक नया 1.5 एमएल microfuge ट्यूब स्तंभ स्थानांतरण और ध्यान से 30 μl फॉस्फेट elution बफर जोड़ने. (समाधान तैयारी अनुभाग देखें)
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं.
- ~~ 1 मिनट के लिए 13,000 rpm पर centrifugation द्वारा Elute.
- उसी ट्यूब में दोहरा 6-8 चरणों द्वारा एक दूसरी बार (फॉस्फेट elution बफर के एक 30 μl साथ) Elute. अंतिम elution मात्रा ~ 60 μl होना चाहिए.
- सीडीएनए की राशि इस चरण में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है:
एनजी सीडीएनए = (कमजोर पड़ने कारक) (OD260) (37) (कुल मात्रा कॉलम से eluted) - एक 45 पर Vac गति में सूखी नमूना ° सी.
- नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता, यदि आवश्यक.
ए.ए. - सीडीएनए युग्मन के लिए डाई एस्टर Cy
- Resuspend 10 μl 50 मिमी ना बिकारबोनिट पीएच 9.0 = यदि आवश्यक हो, के साथ सीडीएनए aminoallyl लेबल. (यह बफर हर दो हफ्ते ताजा किया जाना चाहिए)
- एक अंधेरी जगह में कार्य करना उचित Cy डाई की एक ट्यूब में जांच जोड़ने के. Pipet और नीचे कई बार डाई resuspend.
- 1 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं. (ऊष्मायन दो घंटे तक जा सकते हैं)
रिएक्शन शोधन द्वितीय uncoupled डाई का हटाना:
- प्रतिक्रिया करने के लिए 35 μl 100 मिमी NaOAc 5.2 पीएच जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स.
- 250 μl जोड़ें (या 5X प्रतिक्रिया मात्रा = 225 μl) बफर प्रत्येक नमूना और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण करने के लिए पंजाब (Qiagen की आपूर्ति).
- एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में एक QIAquick स्पिन स्तंभ (Qiagen की आपूर्ति) प्लेस, स्तंभ के लिए नमूना लागू करने के लिए, और 1 मिनट के लिए 13,000 ~ अपकेंद्रित्र. खाली संग्रह ट्यूब.
- धो करने के लिए, स्तंभ और 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र १३००० ~ 0.75 एमएल बफर पीई (Qiagen की आपूर्ति) जोड़ने.
- चरण 4 दोहराएँ.
- खाली संग्रह ट्यूब और अधिकतम गति पर एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र स्तंभ.
- एक साफ 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में रखें स्तंभ और ध्यान से स्तंभ झिल्ली के केंद्र से 30 μl बफर EB (Qiagen की आपूर्ति) जोड़ने.
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं.
- ~~ 1 मिनट के लिए 13,000 rpm पर centrifugation द्वारा Elute.
- उसी ट्यूब में दोहरा द्वारा दूसरी बार Elute7-9 कदम. अंतिम eluted मात्रा ~ 60 μl होना चाहिए.
लेबल रिएक्शन का विश्लेषण
सीडीएनए की राशि और लेबल इस चरण में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है:
- आयुध डिपो 260, 550 और 650 (खाली पानी है.) Nanodrop माइक्रोएरे कार्यक्रम का उपयोग करें उपाय.
- रंजक निगमन और pmol और नीचे दिए गए समीकरणों के साथ nuc / डाई अनुपात डीएनए के pmol की गणना:
pmol nucleotides = [OD260 * मात्रा (μL) * 37 एनजी / μL * 1000 स्नातकोत्तर एनजी / /] 324.5 / स्नातकोत्तर pmol
नोट: एक OD260 = 37 एनजी / सीडीएनए के लिए μL, 324.5 / स्नातकोत्तर pmol एक dNTP की औसत आणविक भार)
pmol Cy3 = OD550 * मात्रा (μL) / 0.15
pmol Cy5 OD650 = * मात्रा (μL) / 0.25
nucleotides / डाई अनुपात = pmol / सीडीएनए pmol Cy डाई
यदि आप nanodrop का उपयोग कर रहे हैं, यह पहले से ही हर रंग के लिए / pmol μl देता है. आप केवल मात्रा द्वारा इस संख्या को गुणा करने के लिए कुल pmol डाई समावेश की जरूरत है.
नोट:> नमूना प्रति डाई निगमन और कम से कम 20 nucleotides / डाई अणु के अनुपात 150-200 pmol hybridizations के लिए इष्टतम है.
- नमूने अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- साथ संकरित हो जांच का मिश्रण है और speedvac में नीचे 42 डिग्री सेल्सियस पर सूखी
- नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता, hyb करने के लिए तैयार है जब तक.
प्री - hyb स्लाइड्स
- प्लेस स्लाइड चेहरा नीचे आरटी से अधिक 100 एमएल पानी में 3-5 मिनट के लिए एक साफ लाल स्लाइड धारक
- चेहरे रखने के कुछ सेकंड के लिए एक 100 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर स्लाइड सूखी स्नैप - देखो के लिए संक्षेपण गायब हो
- यूवी 250 mJoules पर स्लाइड पार से लिंक (यूवी crosslinker 2500 दर्ज करें)
- पूर्व गर्म 42 डिग्री सेल्सियस पानी में सूई से हाइड्रेट स्लाइड. आरटी पर 700 आरपीएम पर 5 मिनट स्पिन.
- सेते स्लाइड्स 50ml Coplin जार में कम से कम 45 मिनट के लिए पूर्व गर्म पूर्व hyb (5XSSC, BSA 1%, 0.1% एसडीएस) युक्त @ 42 डिग्री सेल्सियस, और ऊष्मायन अब जाने के लिए यदि आवश्यक हो तो कर सकते हैं.
50 एमएल पूर्व - hyb बफर: 12.5 एमएल 20x एसएससी, 10 मिलीलीटर 5% BSA, 0.5 मिलीलीटर 10% एसडीएस, 27 एमएल पानी - पूर्व गर्म पानी (42 डिग्री सेल्सियस) में डुबकी स्लाइड और मिनट के एक जोड़े आंदोलन पूर्व hyb बफर हटाने.
- Isopropanol में कुल्ला और 700 rpm, कमरे Temp, सूखे पर 5 मिनट स्पिन.
संकरण के लिए नमूने की तैयारी
- पानी में Resuspend जांच (मात्रा नीचे दिए गए हैं)
कुल खंड के लिए. = 30μl कुल खंड के लिए. = 35μl कुल खंड .= 40μl के लिए 19.8 μl पानी 23.55 μl पानी 27.2 μl पानी 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 10 सामन मिलीग्राम / एमएल शुक्राणु डीएनए (Invitrogen) 1.2 μl 1.2 μl 1.2 μl 12.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर tRNA 4.5 μl 5.25 μl 6 μl 20XSSC (3X अंतिम) 3 μl 3.5 μl 4 μl % 1 एसडीएस
नोट: अभिकर्मकों के अलावा के क्रम महत्वपूर्ण हैं. मास्टर मिश्रण तैयार मत करो. - 5 मिनट के लिए उबाल लें, तो 14,000 rpm पर 5 मिनट स्पिन. कमरे Temp पर 2 मिनट के लिए शांत हो जाओ.
वर्ण - संकर करना
- प्रत्येक किनारे पर और बीच में संकरण चैम्बर के कुओं 3X एसएससी की 10-12 μl जोड़ें.
- स्लाइड के उपयुक्त क्षेत्र के लिए एक साफ चोर पर्ची जोड़ें और धीरे संकरण समाधान में लोड (30 -40 μl). कवर पर्ची के दोनों किनारे पर अतिरिक्त नमूना होना चाहिए.
- चैम्बर में स्लाइड रखें. कसो शिकंजा और एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह रातोरात. चैम्बर पानी के स्नान के नीचे पर सीधे जगह मत करो. ऊपरवाला चैम्बर के शीर्ष पर एक ब्लॉक करने के लिए जगह में सब कुछ पकड़ रखें. पानी के स्नान पर ढक्कन रखने के लिए प्रकाश के प्रति संवेदनशील नमूने की रक्षा के लिए.
Hyb Washes
- निम्नलिखित बफ़र्स तैयार:
- 1X एसएससी, एसडीएस 0.05%
- 0.06 एक्स एसएससी
- ऊष्मायन खोलना संकरण चैम्बर के बाद. कक्ष से स्लाइड निकालें, ध्यान लेने के लिए coverslip परेशान नहीं.
- करने के लिए coverslips निकालने के लिए, एक गर्म 1X एसएससी, 0.05% एसडीएस धोने बफर पकवान के नीचे का सामना करना पड़ coverslip युक्त थाली में डूब स्लाइड. coverslip पक्ष को स्लाइड की ओर आगे बढ़ से गिर जाएगी.
- Coverslip के बाद हटा दिया जाता है, गर्म 1XSSCm एसडीएस 0.05% के साथ एक रैक एक ताजा स्नान में स्लाइड जगह है. मिनट के एक जोड़े के लिए आंदोलन
- 0.06 एक्स एसएससी के स्नान के लिए स्लाइड्स अधिक रैक स्थानांतरण.
- एक और बा के लिए स्लाइड्स स्थानांतरण0.06 एक्स एसएससी एक ताजा रैक युक्त, एक कागज तौलिया पर स्लाइड सोख्ता ताजा स्नान में रखने से पहले संभव के रूप में के रूप में ज्यादा बफर एसडीएस युक्त निकालने का वें.
- मिनट की एक जोड़ी के लिए स्लाइड्स का आंदोलन.
- 5 मिनट @ 700 rpm के लिए कमरे के तापमान पर तुरंत स्पिन, तो स्लाइड्स को स्कैन करने के लिए तैयार हैं. अंधेरे में स्टोर जब तक स्कैन.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AA-dUTP | Sigma-Aldrich | A0410 | 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate | |
| dNTP | Amersham | 27-2035-01 | 100 mM dNTP Set PCR grade | |
| Random Hexamer primers | Amersham | 27-2166-01 | 3mg/mL | |
| SuperScript III RT | Invitrogen | 80800444 | 200U/μL | |
| CyDye™ | Amersham | RPN5661 | Post-Labelling Reactive Dye Pack | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 | PCR Purification kit | |
| 1 M K2HPO4 | ||||
| 1 M KH2PO4 | ||||
| 1 M KPO4 | Buffer | To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4 | ||
| Phosphate wash buffer | Buffer | For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily. | ||
| Phosphate elution buffer | Buffer | Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water | ||
| Sodium Carbonate Buffer | (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month. |
References
- Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.
- Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. , Forthcoming.
- Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. , Forthcoming.
