マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/206

Sinem Beyhan¹, Fitnat Yildiz¹

¹Department of Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz - UCSC

Summary

Protocol

転写酵素反応を逆に

70から80への加熱ブロックを回し° Cと42℃水浴も、このステップで使用することができます。加熱ブロックを使用する場合、熱が均一になるように水を入れる。

プライミング反応
1. RNAの3μgを取る
2. RNaseフリーの水で13μlにボリュームを調整
3. ランダムヘキサマープライマー（2mg/mL）2.5μlを加え、
よく混和して、8分間70〜80℃でインキュベートする。その後、氷上で5分間置きます。

RTカクテルを（14.5μL/ RXN）を準備します。

コンポーネント	ボリューム
5Xファーストストランドバッファー	6μlの
0.1 M DTT	3μlの
25Xアミノアリル- dNTPミックス	1.2μL
のSuperScript II RT（200U/μl）	2.3μL
水	2.0μL

* nの反応では、あなたが不足しないことを保証するためにカクテルのn個の0.5アリコートのためにマスターミックスを調製する。

冷却反応は14.5μlを添加します。
ミックス（ボルテックスしない）と℃で3-4時間、42でインキュベート
必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。

加水分解RNA

各サンプルに、1 N NaOH及び0.5 M EDTAを0.6μlの3μlを加える。（決勝conc.s = 100mMのNaOHを、10mMのEDTA）
混合し、インキュベート65℃で10分間。
33.6μlの1M HEPESを添加することにより中和、pH値= 7.0（最終濃度.=約500mmのHEPES）
サンプルは、必要に応じて-20℃で保存することができます。

反応の精製：非法人AA - dUTPの除去と、遊離アミン

注：この精製プロトコールは、キアゲンQIAクイックのPCRpurificationキットのプロトコルから変更されます。キアゲンのバッファがCyの染料のカップリング反応と競合する遊離アミンを含んでいるため、リン酸塩の洗浄および溶出バッファーは、キアゲン供給されたバッファに代入されます。ミニプレップキットから列を使用することもできます。

300μlの（または5X反応体積= 336μl）のバッファーPB（キアゲン付属）でcDNA反応を混合し、QIAクイックカラムに移す。
2 mlのコレクションチューブにカラム（キアゲン社提供）を配置し、1分間〜13,000 rpmで遠心する。空のコレクションチューブ。
洗浄のため、1分間〜13,000 rpmでカラムと遠心に750μlのリン酸塩の洗浄バッファー（ではないQiagenの）を追加します。
コレクションチューブを空にし、750μlの洗浄と遠心分離のステップを繰り返します。
コレクションチューブを空にし、列の最大速度で、追加1分遠心する。
新しい1.5mlマイクロチューブにカラムを移し、慎重に、30μlのリン酸塩の溶出バッファーを添加します。（溶液調製の項を参照）
室温で1分間インキュベートする。
1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。
手順6〜8を繰り返すことによって、同じチューブにもう一度（リン酸塩の溶出バッファーの別の30μlのある）溶出。最後の溶出量は約60μLにする必要があります。
cDNAの量は、この段階で定量することができる。
ngのcDNAを=（希釈率）（OD260）（37）（カラムから溶出した総量）
45℃VACスピードで乾燥したサンプル℃に
必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。

ダイエステルをCyにAA - cDNAのカップリング

再懸濁し、10μlの50mMのナトリウム - 炭酸水素塩、pH値= 9.0、必要に応じてcDNAをアミノアリル標識。（このバッファは隔週で新鮮なされるべきである）
暗い場所での作業、適切なのCy色素のチューブにプローブを追加します。ピペッティングを数回は、色素を再懸濁します。
室温、暗所で1時間反応をインキュベートする。（インキュベーションは、2時間ほど行くことができる）

反応精製II：非結合色素の除去

反応に35μlの100mMのNaOAcのpHは5.2を追加します。充分に混合する。
ピペッティングすることにより、各試料と混合して250μlの（または5X反応体積= 225μl）をバッファPB（キアゲン付属）を追加します。
2 mlのコレクションチューブにQIAクイックスピンカラム（キアゲン社提供）を配置し、カラムにサンプルを適用し、1分間〜13,000間遠心。空のコレクションチューブ。
洗浄のため、1分間〜13,000で、列と遠心に0.75 mlのBuffer PE（キアゲン付属）を追加します。
手順4を繰り返します。
空のコレクションチューブと最大速度で追加の1分間の遠心カラム。
場所は、新しい1.5 mlマイクロ遠心チューブ内の列と慎重にカラムのメンブレンの中央に30μlのBuffer EB（Qiagen社提供）を追加します。
室温で1分間インキュベートする。
1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。
繰り返すことによって、同じチューブに二度目の溶出ステップ7-9最後の溶出量は約60μLにする必要があります。

ラベリング反応の解析

cDNAの量とラベルは、この段階で定量することができる。

OD 260、550、650（ブランクは水です。）㈱エルマイクロアレイのプログラムを使用して測定します。
染料の取り込みと下記の式でpmolのDNAと色素/ NUC比のpmolを計算します。

pmolのヌクレオチド= [OD 260 *体積（μL）* 37 ng /μLの* 1000 PG / NG] / 324.5 PG / pmolの

注：1 OD260 cDNAのための= 37 ng /μLの、dNTPの324.5 PG / pmolの平均分子量）
pmolのCy3標識= OD550 *体積（μL）/ 0.15
pmolのCy5標識= OD650 *体積（μL）/ 0.25
ヌクレオチド/染料比= pmolのピコモル/ cDNAのCyの染料

あなたが光度計を使用している場合、それはすでにμL/ pmolの各色素のために与える。あなただけの合計pmolの色素の取り込みを取得するにはボリュームでこの数値を乗算する必要があります。

注：染料、サンプルあたりの取り込みと20未満のヌクレオチド/色素分子の比率の> 150から200 pmolのは、ハイブリダイゼーションに最適です。

サンプルは、暗所で-20℃で保存することができます。
- 一緒にハイブリダイズするプローブを組み合わせて、42℃speedvacでダウン乾燥℃の
- サンプルはふたに準備するまで-20℃で保存することができます。

プリふたのスライド

3-5分のためのクリーン赤スライドホルダーの場所のスライド側を下にRT以上100mLの水
数秒のために100℃の加熱ブロックに表向きに配置することにより、スライドを乾燥させるスナップ - 結露が消えるまで待ってください
UVクロスリンク250 mJoules（UVクロスリンカーに2500を入力してください）で、スライド
予め温めておいた42℃の水中に浸漬することによって水和物スライド。 RTで700 RPMで5分間スピン。
必要に応じて、少なくとも45分@ 42℃、およびインキュベーションのために予め温めておいたプリふた（5XSSC、1％BSA、0.1％SDS）を含む50ミリリットルコプリンジャーにスライドをインキュベートすると、長く行くことができます。

50mLのプリふたバッファ：12.5 mLを20 × SSC 10 mlの5％BSA、0.5 mlの10％SDS、27 mLの水
ディップ予め温めておいた水（42℃）でのスライドとは、事前にふたのバッファを削除するには、数分撹拌。
乾燥するために、イソプロパノール及び700rpmで、室温でスピン5分にすすいでください。

ハイブリダイゼーションのためのサンプルの準備

水に再懸プローブ（ボリュームが下与えられます）

合計巻用。 =30μlの	合計巻用。 =35μl	合計巻.=40μlのための
19.8μlの水	23.55μlの水	27.2μlの水
1.5μL	1.5μL	1.5μL	10 mg / mlのサケ精子DNA（Invitrogen社）
1.2μL	1.2μL	1.2μL	12.5 mg / mlのtRNAの
4.5μL	5.25μL	6μlの	20XSSC（3X最終）
3μlの	μlを3.5	4μlの	1％SDS

注：試薬の添加の順序は重要です。マスターミックスを調製してください。

5分間沸騰し、14,000 rpmで5分をスピン。室温で2分間冷却してください。

交配

各辺上と真ん中のハイブリダイゼーションチャンバーのウェルに3倍SSC 10〜12μlを添加する。
スライドの適切な領域にクリーンリフタースリップを加え、穏やかにハイブリダイゼーション溶液（30 -40μL）でロードする。カバースリップのどちらかの端に余分なサンプルがあるはずです。
チャンバー内のスライドを置きます。一晩65℃の水浴中にネジと場所を締めます。水浴の底に直接チャンバーを置かないでください。場所のすべてを保持するために一番上のチャンバーの上にブロックを置きます。光に敏感なサンプルを保護するために水浴上で蓋をしてください。

ふたは洗浄

以下のバッファを準備します。
- 1X SSC、0.05％SDS
- 0.06 X SSC
インキュベーション開封ハイブリダイゼーションチャンバーの後。カバースリップを乱さないように注意しながら、チャンバーからスライドを削除します。
カバースリップを削除するには、暖かい1X SSC、皿の底に直面して0.05％SDSの洗浄緩衝液のカバーを含む皿に浸すのスライド。カバースリップは、サイドにスライド側を移動して減少していきます。
カバースリップを除去した後、ラックのスライド暖かい1XSSCm 0.05％SDSで新鮮なお風呂を配置。数分間攪拌する
0.06 X SSCのお風呂にスライドに加えてラックを転送します。
別のBAにスライドを移し0.06 X SSCは、新鮮なお風呂に入れる前に、できるだけ多くのSDSを含む緩衝液を除去するためにペーパータオルでスライドをブロッティング、新鮮なラックを含むの目。
分のカップルのためのスライドを振とうする。
5分@ 700rpmで室温ですぐにスピンして、スライドにはスキャンする準備が整いました。スキャンするまで暗所で保管してください。

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.