Summary
Protocol
Реакция обратной транскриптазы
Включите нагревательный блок до 70-80 ° С и 42 ° C. Водяные бани также может быть использован в этом шаге. При использовании нагрева блоков, положить немного воды так, чтобы тепло равномерно.
- Грунтовка реакции
- Принимать 3 мкг РНК
- Регулировка громкости до 13 мкл водой РНКазы свободный
- Добавить 2,5 мкл случайных гексамера праймеров (2mg/mL)
- Хорошо перемешать и инкубировать при 70-80 ° С в течение 8 минут. Затем поместите на льду в течение 5 мин.
- Подготовка РТ коктейль (14,5 мкл / Rxn):
Компонент Объем 5X первых буфера Strand 6 мкл 0,1 М ДТТ 3 мкл 25X aminoallyl-дНТФ смеси 1,2 мкл Надстрочный II RT (200U/μl) 2,3 мкл Воды 2,0 мкл
* Для реакций п, подготовка Master Mix для п 0,5 порции коктейля, чтобы заверить, что вы не закончатся. - Добавить 14,5 мкл до охлаждения реакций.
- Mix (не вихря) и инкубировать при 42 ° С в течение 3-4 часов
- Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.
Гидролиза РНК
- Для каждого образца, добавляют 3 мкл 1 N NaOH и 0,6 мкл 0,5 М ЭДТА. (Финальный conc.s = 100мм NaOH, 10 мМ ЭДТА)
- Смешать и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 10 минут.
- Нейтрализовать добавлением 33,6 мкл 1М HEPES, рН = 7,0 (конечная конц .= 500 мм HEPES)
- Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.
Реакция очистка: Удаление неинкорпорированных аа-dUTP и свободные амины
Примечание: Это очищение протокол изменяется от PCRpurification Qiagen протокол QIAquick комплект. Мыть фосфата и элюирования буферов заменить Qiagen поставляется буферов потому Qiagen буферы содержат свободные амины, которые конкурируют с реакции сочетания Cy красителя. Столбцы из мини-приготовительные комплект может также использоваться.
- Смешайте кДНК реакции с 300 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 336 мкл) буфера PB (Qiagen входит в комплект) и трансфер в колонке QIAquick.
- Место колонки в 2 мл пробирки (Qiagen входит в комплект) и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
- Чтобы промыть, добавить 750 мкл промывочного буфера фосфата (не Qiagen), чтобы колонны и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
- Пустые пробирки и повторить 750 мкл мыть и центрифугирования шаг.
- Пустые пробирки и центрифуги колонки еще 1 минуту при максимальной скорости.
- Передача столбец на новое 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера для элюции фосфата. (См. раздел приготовления раствора)
- Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
- Элюировать второй раз (и еще 30 мкл фосфатного буфера элюирования) в ту же трубку, повторив шаги 6-8. Конечный объем элюирования должно быть ~ 60 мкл.
- Количество кДНК может быть определена количественно на этом этапе:
нг кДНК = (коэффициент разбавления) (OD260) (37) (общий объем вымывают из колонки) - Сухой образец в вакууме скорость при 45 ° C.
- Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо.
Муфта аа-кДНК Су Dye Эстер
- Ресуспендируют aminoallyl меченные кДНК с 10 мкл 50 мМ Na-бикарбонат, рН = 9,0, если необходимо. (Этот буфер должен быть свежим каждые две недели)
- Работа в темном месте, добавить зонда трубка соответствующего красителя Су. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендирования красителя.
- Инкубируйте реакции в течение 1 часа в темном месте при комнатной температуре. (Инкубация может доходить до двух часов)
Реакция Очистка II: Удаление несвязанных красителя
- К реакционной добавить 35 мкл 100 мМ NaOAc рН 5,2. Тщательно перемешать.
- Добавить 250 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 225 мкл) буфера PB (Qiagen прилагается) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Место колонке QIAquick спина в 2 мл пробирки (Qiagen в комплект поставки), применять образец столбца, а центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции.
- Чтобы промыть, добавить 0,75 мл буфера PE (Qiagen в комплект поставки) к колонне и центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты.
- Повторите шаг 4.
- Пустая труба сбора и центрифуги колонку еще на 1 минуту при максимальной скорости.
- Место колонку в чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера EB (Qiagen в комплект поставки) к центру колонки мембраны.
- Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
- Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты.
- Элюировать второй раз в ту же трубку, повторяяшаги 7-9. Окончательный элюировали объем должен быть ~ 60 мкл.
Анализ маркировки Реакция
Количество кДНК и метка может быть определена количественно на этом этапе:
- Мера 260 OD, 550 и 650 (Бланк является вода.) Используйте nanodrop программы микрочипов.
- Рассчитать пмоль красителей регистрации и пмоль ДНК и пис / красителя отношения с заданными уравнениями ниже:
пмоль нуклеотидов = [OD260 * объем (мкл) * 37 нг / мкл * 1000 пг / нг] / 324,5 пг / пмоль
Примечание: 1 OD260 = 37 нг / мкл для кДНК; 324,5 пг / пмоль средней молекулярной массой дНТФ)
пмоль Cy3 = OD550 * объем (мкл) / 0,15
пмоль Cy5 = OD650 * объем (мкл) / 0,25
нуклеотидов / красителя соотношение = пмоль кДНК / пмоль Су красителя
Если вы используете nanodrop, это уже дает пмоль / мкл для каждого красителя. Вам нужно только умножить это число на объем, чтобы получить общее пмоль включению красителя.
Обратите внимание:> 150-200 пмоль красителя включения в образец и отношение менее 20 нуклеотидов / молекул красителя является оптимальным для гибридизации.
- Образцы могут храниться при температуре -20 ° С в темноте.
- Комбинат зонды для гибридизированных вместе и сухой вниз в speedvac на 42 ° C.
- Образцы могут храниться при температуре -20 ° С до готовности Hyb.
Предварительно Hyb слайдов
- Лицо Место сползают вниз по РТ 100 мл воды в чистую красный держатель слайдов в течение 3-5 минут
- Привязка сухой слайд, поставив лицом вверх на 100 ° Блок отопления С в течение нескольких секунд - следите за конденсации исчезают
- УФ перекрестные ссылки слайд при 250 mJoules (Введите 2500 до УФ сшивателя)
- Гидратов слайды, опуская в предварительно разогретой воды 42 ° C. Спиновые 5 мин при 700 RPM при комнатной температуре.
- Инкубируйте слайдов в 50 мл банку Коплин содержащие подогретого предварительно Hyb (5XSSC, 1% БСА, 0,1% SDS) не менее 45 минут при 42 ° С, а инкубационный может идти дольше, если это необходимо.
50 мл предварительно Hyb буфера: 12,5 мл 20х SSC, 10 мл 5% БСА, 0,5 мл 10% SDS, 27 мл воды - Dip слайдов в подогретого воде (42 ° С) и агитировать за пару минут, чтобы удалить предварительно Hyb буфера.
- Полоскание в изопропанола и спина 5 мин при 700 оборотах в минуту, комнатной температуры, чтобы высохнуть.
Подготовка образцов для гибридизации
- Ресуспендируют зонд в воде (объемы приведены ниже)
Для общего об. = 30μl Для общего об. = 35μl Для полной том .= 40μl 19,8 мкл воды 23,55 мкл воды 27,2 мкл воды 1,5 мкл 1,5 мкл 1,5 мкл 10 мг / мл ДНК спермы лосося (Invitrogen) 1,2 мкл 1,2 мкл 1,2 мкл 12,5 мг / мл тРНК 4,5 мкл 5,25 мкл 6 мкл 20XSSC (3X окончательный) 3 мкл 3,5 мкл 4 мкл 1% SDS
Примечание: порядок добавления реагентов важны. Не готовьте мастера микса. - Кипятить 5 минут, затем спина 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Прохладный в течение 2 мин при комнатной температуре.
Гибридизация
- Добавить 10-12 мкл 3Х SSC для скважин гибридизации камеры на каждом краю и в центре.
- Добавить чистой скольжения ручка для соответствующей области слайда и аккуратно нагрузки в гибридизации решения (30 -40 мкл). Там должно быть очень образца на обеих боковых покровным стеклом.
- Место слайда в камере. Затяните винты и места в 65 ° С водяной бане в течение ночи. Не устанавливайте камеру непосредственно на дно ванны. Место блока в верхней части верхней камере провести все на месте. Держите крышкой на водяной бане для защиты светочувствительных образцов.
Hyb Моет
- Подготовьте следующие буферов:
- 1X SSC, 0,05% SDS
- 0,06 X SSC
- После инкубации распечатать камеру гибридизации. Удалить слайд из камеры, следя за тем, чтобы не нарушить покровное.
- Для удаления покровные, погрузи слайдов в блюдо с теплой 1X SSC, 0,05% SDS промывочный буфер покровное направлен к нижней части блюда. Покровное будет падать, перемещая слайд стороны в сторону.
- После покровное удаляется, место слайда в стойку свежие ванну с теплой 1XSSCm 0,05% SDS. Агитировать за пару минут
- Передача слайдами плюс стойки для ванны 0,06 X SSC.
- Передача слайдов на другой бам на 0,06 X SSC содержащие свежие стойку, промокательной слайд на бумажное полотенце, чтобы удалить как можно больше SDS-содержащих буфера возможно прежде, чем поместить на свежем ванну.
- Перемешивают слайды в течение нескольких минут.
- Спиновые сразу при комнатной температуре в течение 5 мин при 700 оборотах в минуту, то слайды готов к сканированию. Хранить в темноте, пока проверяются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AA-dUTP | Sigma-Aldrich | A0410 | 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate | |
| dNTP | Amersham | 27-2035-01 | 100 mM dNTP Set PCR grade | |
| Random Hexamer primers | Amersham | 27-2166-01 | 3mg/mL | |
| SuperScript III RT | Invitrogen | 80800444 | 200U/μL | |
| CyDye™ | Amersham | RPN5661 | Post-Labelling Reactive Dye Pack | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 | PCR Purification kit | |
| 1 M K2HPO4 | ||||
| 1 M KH2PO4 | ||||
| 1 M KPO4 | Buffer | To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4 | ||
| Phosphate wash buffer | Buffer | For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily. | ||
| Phosphate elution buffer | Buffer | Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water | ||
| Sodium Carbonate Buffer | (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month. |
References
- Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.
- Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. , Forthcoming.
- Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. , Forthcoming.
