Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Summary

Protocol

Reacción de la transcriptasa inversa

A su vez un calentador a 70-80 ° C y 42 ° C. Baños de agua también se puede utilizar en este paso. Si utiliza bloques de calentamiento, poner un poco de agua para que el calor es uniforme.

1. Cebado reacción
   1. Tomar 3 g de ARN
   2. Ajustar el volumen a 13 ml con agua libre de RNasa
   3. Añadir 2,5 l de azar hexamer primers (2mg/ml)
2. Mezclar bien e incubar a 70-80 ° C durante 8 minutos. Después, coloque en hielo durante 5 min.
3. Preparar cócteles RT (14,5 l / rxn):
   
   

   Componente	Volumen
   Buffer 5X primer capítulo	6 l
   0,1 M TDT	3 l
   25X aminoallyl-Mezcla de dNTP	1,2 l
   Superíndice II RT (200U/μl)	2,3 l
   De agua	2,0 l

   
   * De las reacciones n, preparar mezcla maestra para n 0,5 alícuotas de cóctel para asegurar que no se acabará.
   
   
4. Añadir 14,5 l reacciones enfriado.
5. Mix (no vortex) y se incuba a 42 ° C durante 3-4 horas
6. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C si es necesario.

Hidrolizar ARN

1. Para cada muestra, añadir 3 l de NaOH 1 N y 0,6 l de 0,5 M EDTA. (Final conc.s NaOH = 100 mm, 10 mm EDTA)
2. Mezclar e incubar a 65 ° C durante 10 minutos.
3. Neutralizar mediante la adición de 33,6 HEPES 1M l, pH = 7.0 (final conc .= 500 mm HEPES)
4. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C, si es necesario.

Purificación de la reacción: Eliminación de no incorporadas aa-dUTP y aminas libres

Nota: Este protocolo de purificación es una modificación del protocolo de PCRpurification Qiagen QIAquick kit. El lavado del fosfato y tampones de elución se sustituyen por los buffers Qiagen suministrados por los topes Qiagen contienen aminas libres que compiten con la reacción de acoplamiento Cy tinte. Las columnas de la mini-kit de preparación también se puede utilizar.

1. Mezcla de reacción de cDNA de 300 l (o volumen de reacción 5X = 336 l) buffer PB (Qiagen incluido) y traslado a la columna QIAquick.
2. Colocar la columna en un tubo de recogida de 2 ml (Qiagen incluido) y se centrifuga a ~ 13.000 rpm durante 1 minuto. Tubo de extracción de vacío.
3. Para lavar, añadir 750 l buffer de lavado de fosfato (no de Qiagen) a la columna y centrifugar a ~ 13.000 rpm durante 1 minuto.
4. Vaciar el tubo de recogida y repetir el lavado de 750 l, y la centrifugación.
5. Vaciar el tubo de recogida y centrifugar la columna de un adicional de 1 minuto a máxima velocidad.
6. Transferencia de columna a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y con prudencia, 30 buffer de elución l de fosfato. (Véase la sección preparación de la solución)
7. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
8. Elución por centrifugación a ~ 13.000 rpm durante 1 minuto.
9. Eluir por segunda vez (con otro 30 l de tampón fosfato de elución) en el mismo tubo repitiendo los pasos 6-8. El volumen de elución final debe ser ~ 60 microlitros.
10. La cantidad de cDNA se puede cuantificar en este momento:
    ng cDNA = (dilución de los factores) (DO260) (37) (volumen total eluye de la columna)
11. Muestra seca en un Speed ​​Vac a 45 ° C.
12. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C si es necesario.

Acoplamiento aa-cDNA de Cy Ester tinte

1. Resuspender aminoallyl marcado cDNA con 10 l 50 mM bicarbonato sódico, pH = 9,0 si es necesario. (Este buffer debe ser fresca cada dos semanas)
2. Trabajar en un lugar oscuro, añadir la sonda a un tubo de tinte Cy apropiado. Pipeta veces arriba y abajo varias para volver a suspender el tinte.
3. Incubar la reacción durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. (Incubación puede llegar hasta dos horas)

Reacción de purificación II: La eliminación del colorante desacoplado

1. A la reacción de añadir 35 l 100 mM pH 5,2 NaOAc. Mezclar bien.
2. Añadir 250 l (o volumen de reacción 5X = 225 l) Buffer PB (Qiagen suministrado) para cada muestra y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo.
3. Coloque una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recogida de 2 ml (Qiagen suministrado), aplicar la muestra a la columna y centrifugar a ~ 13.000 durante 1 minuto. Tubo de extracción de vacío.
4. Para lavar, añadir 0,75 ml de tampón PE (Qiagen suministrado) a la columna y centrifugar a ~ 13.000 durante 1 minuto.
5. Repita el paso 4.
6. Tubo de extracción de vacío y la columna de centrifugación durante 1 minuto a velocidad máxima.
7. Columna a cabo en un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml y con prudencia, 30 l Buffer EB (Qiagen incluido) para el centro de la membrana de la columna.
8. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Elución por centrifugación a ~ 13.000 rpm durante 1 minuto.
10. Eluir por segunda vez en el mismo tubo mediante la repetición delos pasos 7-9. El volumen de eluido final debe ser ~ 60 microlitros.

Análisis de la reacción de marcaje

La cantidad de cDNA y la etiqueta se puede cuantificar en este momento:

• Medida DO 260, 550 y 650 (blanco es el agua.) Utilice el programa de microarrays nanodrop.
• Calcular la pmol de incorporación colorantes y el ADN y la relación de nuc pmol / colorante con las ecuaciones que figuran a continuación:
  
  nucleótidos pmol = [DO260 volumen * (l) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Nota: 1 DO260 = 37 ng / mL de cDNA, 324,5 pg / pmol peso molecular medio de un dNTP)
pmol Cy3 OD550 = volumen * (l) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 volumen * (l) / 0,25
nucleótidos / relación de tinte = pmol cDNA / pmol Cy tintes

Si está utilizando nanodrop, que ya da pmol / l para cada tinte. Sólo tiene que multiplicar este número por el volumen para conseguir la incorporación total de tinte pmol.

Nota:> 150-200 pmol de incorporación de la tintura por cada muestra y una proporción de menos de 20 nucleótidos / moléculas de colorante es óptimo para las hibridaciones.

• Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C en la oscuridad.
  • Combine las sondas que se hibridan entre sí y seco en el speedvac a 42 ° C.
  • Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C hasta el momento de hyb.

Pre-hyb diapositivas

1. Lugar frente a deslizarse hacia abajo por RT 100 ml de agua en un portaobjetos limpio roja durante 3-5 minutos
2. Ajustar la diapositiva seca colocando boca arriba sobre un bloque de calentamiento de 100 ° C durante unos segundos - velar por la condensación de desaparecer
3. UV cross-link de la diapositiva a 250 mJoules (Escriba 2500 para la reticulación UV)
4. Diapositivas de hidratos por inmersión en el pre-calentado 42 ° C el agua. Girar 5 minutos a 700 rpm a temperatura ambiente.
5. Diapositivas se incuban en 50 ml frasco de Coplin que contiene pre-calentado previamente hyb (5XSSC, BSA al 1%, 0,1% SDS) durante al menos 45 minutos a 42 ° C, y la incubación puede durar más tiempo si es necesario.
   
   50 ml antes de la hibridación buffer: 12,5 ml 20x SSC, 10 ml 5% de BSA, 0,5 ml de SDS al 10%, 27 ml de agua
   
   
6. Sumerja los portaobjetos en agua previamente calentada (42 ° C) y agitar un par de minutos para eliminar pre-hibridación de amortiguación.
7. Enjuague con isopropanol y el giro 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente y seco para.

Preparación de muestras para la hibridación

1. Sonda resuspender en agua (el volumen se indican a continuación)
   
   

   Para el total de volumen. = 30μl	Para el total de volumen. = 35μl	Para el total de 40μl vol .=
   19,8 l de agua	23,55 l de agua	27,2 l de agua
   1,5 l	1,5 l	1,5 l	10 mg / ml de ADN de esperma de salmón (Invitrogen)
   1,2 l	1,2 l	1,2 l	12,5 mg / ml tRNA
   4,5 l	5,25 l	6 l	20XSSC (3X final)
   3 l	L 3,5	4 l	SDS al 1%

   
   Nota: El orden de adición de los reactivos son importantes. No preparar la mezcla principal.
   
   
2. Hervir durante 5 minutos, luego girar 5 minutos a 14.000 rpm. Deje enfriar durante 2 min a temperatura ambiente.

Hibridación

1. Añadir 10-12 l de 3X SSC a los pozos de la cámara de hibridación en cada borde y en el medio.
2. Añadir una hoja de levantador de limpieza en el área adecuada de la diapositiva y la suavidad de carga en solución de hibridación (30 -40 l). No debe ser muestra adicional sobre cualquiera de los bordes de la hoja de la cubierta.
3. Colocar la placa en la cámara. Apretar los tornillos y colocar en un baño de agua de 65 ° C durante la noche. No coloque la cámara directamente sobre el fondo del baño de agua. Coloque un bloque en la parte superior de la cámara hacia arriba para mantener todo en su lugar. Mantenga la tapa en el baño de agua para proteger las muestras sensibles a la luz.

Hyb Lava

1. Prepare los siguientes topes:
   • 1X SSC, SDS al 0,05%
   • 0.06 X SSC
2. Después de la cámara de incubación hibridación desprecintar. Elimina la diapositiva de la cámara, teniendo cuidado de no perturbar el cubreobjetos.
3. Para eliminar cubreobjetos, diapositivas sumergirse en un recipiente lleno de cálida SSC 1X, 0,05% SDS cubreobjetos tampón de lavado que enfrenta el fondo del plato. El cubreobjetos se caerá por el lado de diapositivas en movimiento a otro.
4. Después de que el cubreobjetos se retira, colocar la placa en un bastidor de un refrescante baño con agua tibia SDS 1XSSCm 0,05%. Manifestarse a favor de un par de minutos
5. Transferencia de diapositivas, además de rack para un baño de 0,06 X SSC.
6. Transferencia de diapositivas a otro baª de 0,06 X SSC que contiene una rejilla nueva, borrar la diapositiva sobre una toalla de papel para eliminar la mayor cantidad de SDS-tampón que contiene como sea posible antes de colocar en el baño fresco.
7. Agite desliza por un par de minutos.
8. Girar inmediatamente a temperatura ambiente durante 5 min a 700 rpm, se desliza esté listo para escanear. Almacenar en la oscuridad hasta escaneados.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.