مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

Summary

في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة

Abstract

المجراة في التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (2PLSM) يسمح لدراسة الخلايا الحية وعمليات الخلايا العصبية في الدماغ سليمة. التقنية المقدمة هنا يسمح التصوير من نفس المنطقة من الدماغ في الوقت عدة نقاط (التصوير المزمنة) مع قرار السماح للالمجهرية تتبع في العمود الفقري شجيري التي هي هياكل الصغيرة التي تمثل الغالبية العظمى من المواقع مثير بعد المشبكي في الجهاز العصبي المركزي. القدرة على حل بوضوح الهياكل القشرية غرامة على نقاط عدة مرات العديد من المزايا ، وتحديدا في دراسة الدماغ في اللدونة التي تغيرات شكلية في نقاط الاشتباك العصبي ، وإعادة تشكيل الدوائر قد يساعد في تفسير الآليات الكامنة. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للمزمنة في الجسم الحي من تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة. إعداد ضعفت - الجمجمة هو نهج مينيملي ، الذي يتجنب احتمال حدوث تلف و / أو قشرة الجافية ، وبالتالي تقليل ظهور رد فعل للالتهابات. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، فمن الممكن لرصد التغيرات في الخصائص بوضوح شجيري العمود الفقري في الدماغ سليمة على مدى فترة طويلة من الزمن.

Protocol

1. لتصور الخلايا العصبية في الدماغ سليمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، والتحضير حيث وصفت الخلايا العصبية مع علامات الفلورسنت المستخدمة. في التجارب المقدمة هنا نستخدم الماوس المعدلة وراثيا GFP - M الذي تسميات خط طبقة الخلايا الهرمية 5 ^1. طبقة 5 خلايا هرمية المشروع شجيري العمليات في الطبقات السطحية ، والسماح للتصور من التشعبات والعمود الفقري شجيري يصل إلى عمق 300 ميكرومتر دون مستوى الحنون. نهج بديل يتمثل في استخدام الخلايا تسمية علامات الفيروسية (انظر لوري وآخرون ، التي قدمت إلى إن الرب).
2. تعقيم مساحة العمل باستخدام الايثانول 70 ٪ وأدوات تعقيم لجراحة العقيم. تغطية التشغيل السطح مع خلع الملابس النظيفة.
3. تخدير الفئران مع كوكتيل الفنتانيل (الفنتانيل 0.05 ملغم / كغم ؛ الميدازولام 5 ملغ / كلغ ؛ metatomadin 0.5 ملغ / كلغ) ، تليها جرعة ربع AVERTIN (0.0075 ملغم / لتر) باستخدام IACUC الإجراءات المعتمدة. يمهد للمعالجة الفئران مع المسكنات ، والبوبرينورفين (0.5 ملغ / كلغ) تدار تحت الجلد (SQ). رصد مستوى الطائرة مخدر اختبار رد الفعل الى الذيل / اصبع قرصة.
4. الحفاظ على الحيوانات في 37.5 درجة مئوية باستخدام بطانية للتدفئة مع ترمومتر المستقيم المرفقة.
5. تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع العينين من الجفاف. عيون هود مع ورقة صغيرة من الورق لحماية العينين من مصدر الضوء أثناء الجراحة.
6. باستخدام مقص ، وإزالة الشعر من مؤخرة الرأس (خلف الأذن) في العينين.
7. يتبع تنظيف الجزء العلوي من الرأس الحيوان مع التطبيق متتابعة من الايثانول 70 ٪ ، عن طريق فرك betadine betadine والحل.
8. إجراء شق L - قطع خلف الأذنين وعلى طول الجانب إما الأيمن أو الأيسر من خط الوسط (اعتمادا على نصف الكرة الأرضية الذي سيتم تصويره) في العينين. طية الجلد أكثر من موقع ، وبعيدا عن الجراحة. لا تقم بإزالة الجلد حيث سيتم خياطة الجلد التالية للدورة التصوير.
9. باستخدام الملقط غرامة برفق الجلد وحتى بعيدا من اهتماماتك.
10. كشط بلطف بعيدا سمحاق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع ملقط نظيف أو شفرة المجهرية. استخدام مسحة القطن ، وتطبيق كمية صغيرة من كلوريد الحديديك 10 ٪ في الجمجمة حتى يجف تماما الغشاء سمحاق وضمان أنه قد تم إزالته تماما. من المهم أن الجمجمة جافة تماما لضمان الالتزام السليم من الغراء (انظر 11). باستخدام الملقط أو شفرة المجهرية ، كشط بلطف بعيدا المجففة غشاء السمحاق.
11. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate حول نافذة التصوير من الواح الصلب غير القابل للصدأ الرأس (انظر الشكل 1) ويلصق لوحة في الجمجمة.
12. نهاية باستخدام عصا خشبية من القطن المسحة ، وتطبيق الغراء لطبقات داخل إطار التصوير ، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة.
13. وضع قطرة من الصمغ التسريع في النافذة. يمسح بسرعة بعيدا الزائدة التسريع الغراء مع مسحة القطن أو مسح كيم. يجب أن يكون الغراء توطد تماما قبل الحفر.
14. تبدأ رقيقة الجمجمة في إطار التصوير باستخدام حفر الأسنان الملصقة مع 0.7 مم لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ. حفر بديلة مع التطبيق أحيانا عقيمة المالحة 0.9 ٪ لتجنب توليد الكثير من الحرارة على الجمجمة.
15. رقيقة ملم 4X4 نافذة على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة على سطح الجمجمة مع حفر الأسنان. اختبار ركاكة من الجمجمة مع ملقط نهاية حادة. سوف سطح الجمجمة البادئة قليلا مع ضغط لطيف. سمك الجمجمة الأمثل لتصوير ما بين 10 و 30 ميكرومتر.
16. عندما الجمجمة هي رقيقة والإطار تنظيفها من كل الحطام والمكان المالحة على الجمجمة. صورة نافذة التصوير مع الكاميرا الرقمية التي شنت على نطاق وتشريح. والتصوير الفوتوغرافي واستخدام الأوعية الدموية في الدماغ تساعد في تحديد مكان وجود موقف لوضع لوحة التصوير لجلسات التصوير لاحقة.
17. نقل الحيوانات إلى تلاعب 2 - الفوتون. ينبغي أن تبقى على الحيوان بطانية للتدفئة (المستقيم مع التحقيق) خلال الدورة التصوير بأكمله. ملاحظة : عندما تكون تحت التخدير ، ودرجة حرارة جسم الحيوان الأساسية سوف تتقلب بشكل كبير في غياب وحدة التدفئة مما أدى إلى أضرار القشرية أو ربما الموت.
18. ويستخدم مجهر ثنائي الفوتون مع ليزر ماي تاي ، وهو 10W مضخة الحالة الصلبة لأقصى قدر من السلطة وأوليمبوس تعديل وحدة مبائر Fluoview. تم تحسين نظام للتصوير الأنسجة العميقة ويتم تثبيت كاشفات الخارجية أقرب إلى الهدف ممكن للسماح للكشف القصوى لمضان من الدماغ. يتم استخدام LUMPlan أوليمبوس الهدف 20X/0.95NA فلوريدا / IR العدسة. وتستخدم المياه المالحة 0.9 ٪ خلال التصوير لغمر الهدف.
19. استخدام هذا المجهر ، وتقريب رقمي منخفضة (X1) تحديد منطقة تحتوي على الخلايا العصبية المسماة الزاهية.
20. استخدام الكاميرا الرقمية الملصقة على قطعة المجهر العين ، ويلتقط صورا للمنطقة التصوير. بدلا من ذلك ، يرسم نمط الأوعية الدموية في الدم. هذا أمر ضروري لإعادةأنتقل إلى موقع التصوير نفسه في نقطة زمنية لاحقة.
21. الحصول على المكدس التكبير المنخفض (X20 الهدف ، 512x512 بكسل ، 5 الخطوة ميكرون) من خلال مدى مرئية بالكامل من الدماغ (الذي يمتد عادة ~ 200 ميكرون) مما يبين مدى تشعب شجيري. ملاحظة : سيتم استخدام هذه الصورة التكبير المنخفضة لتحديد منطقة التصوير في نقاط وقت لاحق كما الأوعية الدموية على حد سواء ، والحفاظ على هيكلها التشعبات في الحيوانات الصغار والكبار.
22. التصوير باستخدام برنامج (Fluoview ، V. 5.0 ، FV300) ، وزيادة التكبير الرقمي 8 أضعاف. ضبط إحداثيات س ، ص (PAN إحداثيات) إذا لزم الأمر ، وجمع كومة التكبير العالية التي سوف تظهر مورفولوجيا شجيري مفصلة بما في ذلك مواقع وهيكل العمود الفقري شجيري. تدوين ملاحظات مفصلة عن كل مجموعة مكدس ، أي عموم الإحداثيات ، ومجموعة من جمع وحجم ض خطوة وعدد من الخطوات في الكدسة. وسيتم استخدام هذه الملاحظات عند عودته الى هذا تغصن أو محور عصبي في نقطة زمنية لاحقة.
23. بعد التصوير ، وإزالة لوحة فصل رأسه بلطف لوحة من سطح الجمجمة. باستخدام الملقط ، وإزالة أي بقايا الغراء المتبقية على سطح الجمجمة والجمجمة مع مسح المالحة عقيمة 0.9 ٪. خياطة الجلد فوق الجمجمة معا باستخدام # 6 الصفحات خياطة. مسح المنطقة مع الايثانول 70 ٪. لتخفيف الألم أثناء التعافي بعد الجراحة ، وإدارة مسكن البوبرينورفين 0.1 ملغ / كلغ ، SQ.
24. مكان الحيوان في القفص نظيفة تحت مصباح الحرارة حتى يستيقظ ، والمحمول. عودة إلى قفص الحيوان الأصلي.
25. الحيوان reimage في وقت لاحق نقطة (نقطة وقتنا ويمكن في أي مكان التصوير في الفترة من 2 إلى أيام عدة أشهر بعيدا) ، إزالة أو إعادة فتح غرز الجلد على الرأس باستخدام أساليب العقيم على النحو الوارد أعلاه. استخدام الصور الرقمية من الأوعية الدموية في الدماغ (التي اتخذت في تاريخ الجراحة الأولى) لتحديد موقع التصوير الأصلي. Reaffix headplate الفولاذ المقاوم للصدأ (الخطوات 10-12). استخدام شفرة المجهرية رقيقة بلطف بعيدا أي العظام التي قد تكون إعادة نمت بين نقاط وقت التصوير. إذا لزم الأمر ، رقيقة مع حفر الأسنان. نافذة واضحة التصوير من الحطام وتطبيق قطرة من المياه المالحة عقيمة 0.9 ٪.
26. تحمل الحيوانات لاثنين من الفوتون المجهر وتحديد مجال التصوير الأصلي. استخدام الصورة الرقمية التي اتخذت خلال الدورة الأولى للتصوير المساعدة.
27. فتح البرنامج وفتح Fluoview الأصلي صورة التكبير منخفضة. لصق ورقة الشفافية على شاشة الكمبيوتر والرسم والاوعية الدموية الرئيسية النمط باستخدام قلم الشفافية.
28. فتح الصورة الحية ويعيد تنظيم الدم الأوعية الدموية للنمط رسمت على الفيلم الشفافية.
29. لreimage 8X والتكبير في الهياكل ، وفتح المكدس المطلوب جمعها من الدورة السابقة التصوير. رسم الهيكل (أي محواري ، شجيري ، الدبقية) على فيلم والشفافية ، والملصقة على شاشة الكمبيوتر.
30. تكبير 8X من صورة حية وتعيين الإحداثيات لعموم المعلمات يوم التصوير الأول. اعتمادا على دقة محاذاة موقع التكبير منخفضة ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط زاوية من الصورة قليلا. مرة واحدة تم العثور على الهيكل المطلوب ، لتصل المباراة إلى الهيكل الخاص رسمت نمط التكبير عالية. جمع ض المكدس مع حجم خطوة مماثلة ، وعدد من Z - المكدس لتحليل الصور اللاحقة.
31. كرر الخطوات 29 و 30 حتى يتم كل الصور عالية التكبير إعادة جمعها.
32. عند اكتمال التصوير ، كرر الخطوات من 22-24. ويمكن تكرار إعادة التصوير بسرعة تصل الى 2 نقطة زمنية منفصلة.
33. وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الحظيرة وشعبة الطب مختبر الحيوان من جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان ، والاعتماد الكامل من قبل الرابطة لتقييم واعتماد المختبرات رعاية الحيوان ، الدولية (AAALAC) وامتثالا لدولة القانون ، القانون الفيدرالي ، وسياسة المعاهد الوطنية للصحة.

ممثل النتائج

في GFP - M معربا عن الفئران ، يمكن أن مجموعة فرعية من طبقة الخلايا الهرمية 5 والعمليات المقابلة شجيري يمكن بسهولة تصور باستخدام 2 الفوتون المجهري مسح الليزر (2PLSM) ^1. تظاهر هنا لدينا إعداد ضعفت - الجمجمة التي ضعفت الجمجمة حول موقع التصوير المطلوب ل10-30 ميكرومتر ~. بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، علينا وضع تصور واضح والتشعبات القشرية العمود الفقري في القشرة البصرية سليمة للتحليل حاد أو مزمن (الشكل 2).

الشكل 1. لوحة مخصصة الرأس والقاعدة : (أ) أعلى عرض مخصص رأس وقدم لوحة الأساسية المستخدمة لإعداد جراحة ضعفت - الجمجمة. (ب) عرض الجانب العرف من صنع لوحة الرأس والقاعدة. (C ، D) وصورة تخطيطية تفصيلية لوحة الرأس.

في الجسم الحي في القشرة البصرية للماوس GFP - M المعدلة وراثيا باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. الصورة هي صورة واحدة من الإسقاط حصل كل من 5 ميكرون الحنون إلى عمق النهائي من 175 ميكرون. محاصر في المنطقة ويمثل المنطقة في تضخيم (B) و (C) التقط في اليوم 0 (D0) وبعد ذلك بأربعة أيام (D4). خسر (D ، E) التكبير العالي فرع شجيري محاصر في وباء وجيم يتظاهرون أشواك مستقرة (رؤوس السهم الأبيض) ، والعمود الفقري التراجع / (رؤساء السهم الأحمر) ، والعمود الفقري جديدة (رؤساء السهم الأخضر). أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر ألف وباء وجيم 20 ميكرون ، D ، E. 5 ميكرون.

Discussion

التصوير المزمنة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري أصبحت تقنية شعبية متزايدة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثار خلال اللدونة ^2-5. هنا علينا أن نظهر استعدادا ضعفت - الجمجمة لمتابعة العمود الفقري شجيري التي تم تحديدها في مخ الفأر سليمة في أيام التصوير المختلفة. في هذا البروتوكول ، يتم ترك الجمجمة سليمة ، مما تسبب في أضرار طفيفة في القشرة ويؤدي إلى مستويات منخفضة جدا من neuroinflammation الذي قد يغير وظيفة المخ ^6. وهذا يسمح ليمكن تصوير الحيوان فورا بعد الجراحة أولا ثم في وقت لاحق يوم reimaged لسنوات لاحقة. هذا هو أسلوب قوي ولكن له أيضا حدوده. إعداد إطار أكثر الغازية التي تنطوي على حج القحف وتفعيل الدبقية المرتبطة بالتالي ، يسمح التصوير تكرار الدماغ مع عدد من جلسات التصوير التعسفي في حين أن الإطار في الجمجمة واضح. إعداد رقيقة الجمجمة ، ومع ذلك ، يقتصر على جلسات التصوير في أكثر ثلاثة بسبب جراحة المشاركة في افتتاح واختتام جلد الفأر. بالإضافة إلى ذلك ، عمق تغلغل متفوقة في إطار ² الجمجمة. ولذلك ينبغي النظر بعناية تؤخذ عند البت النهج الجراحية للتجارب التصوير المزمنة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12