In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die chronische In vivo Abbildung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung.
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Methodenartikel
Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ermöglicht die Untersuchung von lebenden Zellen und neuronalen Prozesse im intakten Gehirn. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Abbildung des gleichen Bereich des Gehirns zu verschiedenen Zeitpunkten (chronische Imaging) mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Dornen, die die kleinen Strukturen, die die Mehrheit der postsynaptischen exzitatorischen Seiten im ZNS darstellen. Die Fähigkeit, klar zu lösen feinen kortikalen Strukturen über mehrere Zeitpunkte hat viele Vorteile, insbesondere bei der Untersuchung der Plastizität des Gehirns, in denen morphologische Veränderungen an den Synapsen und Schaltung Umbau erklären helfen, zugrunde liegenden Mechanismen können. In diesem Video-und Zusatzmaterial, zeigen wir ein Protokoll für chronischen in vivo-Bildgebung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung. Die ausgedünnten Schädel Präparat ist ein minimal-invasiven Ansatz, der mögliche Schäden an der Dura und / oder Cortex vermeidet, wodurch die Entstehung einer entzündlichen Reaktion. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, ist es möglich, deutlich Überwachung von Änderungen in dendritischen Dorn Eigenschaften im intakten Gehirn über einen längeren Zeitraum.
Protokoll
- Zur Visualisierung Neuronen im intakten Gehirn über Zwei-Photonen-Mikroskopie, ein Präparat, wo Nervenzellen mit fluoreszierenden Markern versehen werden wird. In den Experimenten stellte hier benutzen wir die GFP-M transgenen Maus Linie, die Schicht Etiketten 5 Pyramidenzellen 1. Layer 5 Pyramidenzellen Projekt dendritischen Prozesse in oberflächlichen Schichten, so dass die Visualisierung von Dendriten und dendritischen Dornen bis zu einer Tiefe von 300 um unter dem Niveau der Pia. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Label-Zellen unter Verwendung von viralen Markern (siehe Lowery et al., Eingereicht JOVE).
- Sterilisieren der Arbeitsbereich mit 70% E....
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Diskussion
Chronische Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein zunehmend beliebtes Verfahren, um morphologische Veränderungen während der Plastizität 2-5 ausgelöst studieren. Hier zeigen wir eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung auf die identifizierten dendritischen Dornen im intakten Gehirn der Maus auf verschiedenen bildgebenden Tagen folgen. In diesem Protokoll wird der Schädel intakt gelassen, wodurch minimale Schäden an der Rinde und was zu einem sehr niedrigen Niveau von Neuroinflammation die Funktion .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Burroughs Wellcome Career Award in der Biomedical Sciences (AKM) unterstützt, die Whitehall Foundation Research Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM) und eine NEI finanziert Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Fentanylzitrat | In Haus | Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail IP-Dosis: 0,0125 ml/g Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg | ||
| Medetomidinhydrochlorid | In Haus | Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail IP-Dosis: 0,0125 ml/g Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg | ||
| Midazolam HCl | In Haus | Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail IP-Dosis: 0,0125 ml/g Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg | ||
| 2,2,2-Tribrom–Ethanol | Avertin-Cocktail: Anästhetikum; IP-Dosis: 0,0075 ml/g Endkonzentration des Cocktails: 1 % | |||
| 2-Methyl-2-butanol (Endkonzentration: 0,775 %) | Avertin-Cocktail: Anästhetikum; IP-Dosis: 0,0075 ml/g Endkonzentration der Cocktails: 0,775 % | |||
| TC-1000 Temperaturregulierungssystem für Mäuse | CWE, Inc. | TC-1000 Maus | Körpertemperaturregulation | |
| Toberadex | In Hausproduktion | Augensalbe | ||
| 10 % Eisen(III)-chlorid | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Mikrochirurgisches Messer | Sable Industries | S-6400 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Cyanoacrylat 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Cyanoacrylat 401 | Loctite | P/N 40140 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Zip Kicker Klebeschleuniger | Pacer Technology | PT-29 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Mikrobohrer-Stahlfräser, 0,7 mm Spitzendurchmesser | Fine Science Tools | 19008-07 | Präparation am dünnen Schädel | |
| Microtorque-Steuerbox und Tech2000-Handstück | Ram Products, Inc. | TECH2000 EIN/AUS | Dünnschädelpräparation | |
| #6-0 (0,7 metrisch) Seidennaht | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Augenverbandzange, 10 cm, Spitzenbreite 0,5 mm, gebogen | Chirurgische Instrumente | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extrafeine Bonn-Scheren, 8,5 cm, gerade Spitze, Schneidkante 13 mm | Chirurgische Instrumente | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard-Pinzette, gerade, 2,5 mm × 1,35 mm Spitze, 12 cm | Chirurgische Instrumente | Fine Science Tools | 11000-12 |
Referenzen
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
