Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Summary

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor chronische

Abstract

In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton laser scanning microscopie (2PLSM) maakt de studie van levende cellen en neuronale processen in de intacte hersenen. De techniek hier gepresenteerde maakt de beeldvorming van hetzelfde gebied van de hersenen op verschillende tijdstippen (chronische imaging) met microscopische resolutie waardoor het volgen van dendritische spines die de kleine structuren die de meerderheid van de postsynaptische prikkelende locaties in het CZS te vertegenwoordigen. Het vermogen om helder fijne corticale structuren op te lossen via verschillende tijdstippen heeft vele voordelen, met name in de studie van de hersenen plasticiteit waarin morfologische veranderingen in synapsen en circuit remodelleren kan helpen verklaren onderliggende mechanismen. In deze video-en aanvullend materiaal, tonen we een protocol voor chronische in vivo beeldvorming van de intacte hersenen met behulp van een verdunde-schedel voorbereiding. De verdunde-schedel preparaat is een minimaal invasieve benadering, die potentiële schade aan de dura en / of cortex voorkomt, waardoor het begin van een ontstekingsreactie. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, is het mogelijk om duidelijk de evolutie in de dendritische wervelkolom kenmerken in de intacte hersenen gedurende een langere periode van tijd.

Protocol

1. Te visualiseren neuronen in de intacte hersenen met behulp van twee-foton microscopie, een voorbereiding waar de neuronen worden gelabeld met een fluorescerende merkers wordt gebruikt. In de experimenten die hier gebruiken we de GFP-M transgene muis lijn die labels laag 5 piramidale cellen ^1. Laag 5 piramidale cellen project dendritische processen in oppervlakkige lagen, waardoor de visualisatie van dendrieten en dendritische spines tot een diepte van 300 micrometer onder het niveau van de pia. Een alternatieve aanpak is om het etiket cellen met behulp van virale markers (zie Lowery et al.. Voorgelegd aan Jupiter).
2. Steriliseer de werkruimte met behulp van 70% ethanol en autoclaaf tools voor aseptische chirurgie. De exploitatie-oppervlak met schoon dressing.
3. Verdoven muizen met een Fentanyl cocktail (fentanyl 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg), gevolgd door een kwart dosis Avertin (0,0075 mg / ml) met behulp van IACUC goedgekeurde procedures. Voorbehandelen muizen met de pijnstillende, buprenorfine (0,5 mg / kg) subcutaan (SQ). Toezicht op het niveau van de verdoving vliegtuig door het testen van reactie op de staart / teen knijpen.
4. Houden van dieren bij 37,5 ° C met behulp van warmte deken met aangehechte rectale thermometer.
5. Van toepassing zijn oogheelkundige zalf voor de ogen om de ogen niet uitdrogen. Kap ogen met kleine vel papier voor de ogen te beschermen tegen de lichtbron tijdens de operatie.
6. Met een schaar, te verwijderen haren vanaf de achterkant van het hoofd (achter de oren), voor de ogen.
7. Reinig de bovenkant van het hoofd van het dier met een sequentiële toepassing van 70% ethanol, gevolgd door de Betadine scrub en Betadine-oplossing.
8. Maak een L-snede incisie achter de oren en langs zowel de linker-of rechterkant van de middellijn (afhankelijk van welke halfrond zal worden afgebeeld) voor de ogen. Vouw de huid over en uit de buurt van een operatie site. Verwijder niet de huid als de huid wordt gehecht na de opnamesessie.
9. Met behulp van fijne tang trek de huid omhoog en weg van uw interessegebied.
10. Schraap voorzichtig het periost van het blootgestelde oppervlak van de schedel met een schone pincet of een microchirurgische mes. Met behulp van een wattenstaafje, breng een kleine hoeveelheid van 10% IJzer-chloride in de schedel volledig droog het periost membraan en dat het volledig is verwijderd te verzekeren. Het is belangrijk dat de schedel volledig droog is om een ​​goede hechtende van de lijm te garanderen (zie 11). Met behulp van een tang of een microchirurgische blad, voorzichtig weg te schrapen gedroogde periosteum membraan.
11. Breng een dun laagje van cyanoacrylaat lijm rond de beeldvorming raam van de roestvrij stalen kop plaat (zie figuur 1) en het aanbrengen van de plaat aan de schedel.
12. Met behulp van de houten einde van een katoen-swab stick, lijm naar binnen naden van de imaging-venster, zorg ervoor dat alle leemtes op te vullen tussen de beeldvorming plaat en kromming van de schedel.
13. Plaats een druppel lijm versneller in het venster. Snel weg veeg overtollige lijm versneller met een wattenstaafje of kim vegen. De lijm moet volledig gestold voordat u gaat boren.
14. Begin met de schedel dun in de imaging-venster met behulp van een tandartsboor is voorzien van een 0,7 mm roestvrij staal braam. Wissel boren met af en toe de toepassing van 0,9% steriele zoutoplossing om te voorkomen dat het genereren van al te veel warmte op de schedel.
15. Dunne een 4x4 mm venster op de schedel met kleine halen over de schedel oppervlak met de tandartsboor. Test de geringe dikte van de schedel met stompe eind pincet. De schedel oppervlak zal licht streepje, met lichte druk. De optimale dikte van de schedel voor de beeldvorming ligt tussen 10 en 30 um.
16. Wanneer de schedel dun is en het venster ontdaan van alle puin, plaats zoutoplossing op de schedel. Foto van de beeldvorming venster met een digitale camera gemonteerd op een ontleden scope. Fotografie en het gebruik van de hersenen vasculatuur zal helpen bij het lokaliseren van de positie om de beeldvorming plaat plaats voor latere beeldvorming sessies.
17. Vervoer het dier naar de twee-foton rig. Het dier moet blijven liggen op de verwarming deken (met rectale probe) tijdens de volledige opnamesessie. Let op: terwijl onder sedatie, het dier kerntemperatuur van het lichaam sterk zal fluctueren in de afwezigheid van een verwarmings-unit resulteert in corticale schade of eventueel de dood.
18. Een twee-foton microscoop met een Mai Tai laser, een 10W solid state pomp voor maximaal vermogen en een aangepaste Olympus Fluoview confocale-eenheid wordt gebruikt. Het systeem is geoptimaliseerd voor deep tissue beeldvorming en externe detectoren worden geplaatst zo dicht mogelijk bij de objectief mogelijk tot maximale detectie van fluorescentie toestaan ​​van de hersenen. Een Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objectief wordt gebruikt. 0,9% zoutoplossing wordt gebruikt tijdens de beeldvorming voor de doelstelling van onderdompeling.
19. Met behulp van deze microscoop, en een lage digitale zoom (x1) identificeren een gebied met fel gelabeld neuronen.
20. Met behulp van een digitale camera aangebracht op de microscoop oculair, neem een ​​foto van de beeldvorming gebied. Als alternatief, schetsen het bloed vasculatuur patroon. Dit is nodig om opnieuwbeurt om op dezelfde imaging locatie op een later tijdstip.
21. Verkrijgen van een lage vergroting stack (x20 doel, 512x512 pixel, 5 um stap) door het gehele zichtbare omvang van de hersenen (meestal spanning ~ 200 pm), waaruit de omvang van dendritische vertakking. Let op: deze lage vergroting afbeelding zal worden gebruikt om de beeldvorming buurt te zoeken op latere tijdstippen als zowel de bloedvaten en dendrieten behouden hun structuur in jonge en volwassen dieren.
22. Met behulp van imaging-software (Fluoview, v. 5.0, FV300), toename van digitale vergroting 8-voudige. Stel de X, Y-coördinaten (pan coördinaten), indien nodig en het verzamelen van een hoge vergrotingsfactor stack die gedetailleerde dendritische morfologie inclusief de locaties en de structuur van dendritische spines zal laten zien. Maak gedetailleerde opmerkingen ten aanzien van elke stapel verzamelen, dat wil zeggen pan coördinaten, het bereik van de collectie, de z-stap grootte en het aantal stappen in je stack. Deze nota's zullen worden gebruikt bij het terugkeren naar deze dendriet of axon op een later tijdstip.
23. Na de beeldvorming, verwijder de kop plaat door zachtjes te scheiden plaat uit schedel oppervlak. Met behulp van een tang, verwijder eventuele lijmresten nog op de schedel en wrijf schedel oppervlak met 0,9% steriele zoutoplossing. Suture de huid over de schedel samen met # 6 hechten draad. Veeg gebied met 70% ethanol. Te verlichten pijn tijdens het postoperatieve herstel, het beheer van 0,1 mg / kg Buprenorfine pijnstillend, SQ.
24. Plaats van dieren in een schone kooi onder een warmtelamp totdat hij wakker en is mobiel. Keer terug naar de oorspronkelijke dier kooi.
25. Om Reimage dier op een later tijdstip (onze beeldvorming tijdstippen kan overal worden vanaf 2 dagen tot vele maanden uit elkaar), verwijder steken of heropenen van de huid op het hoofd met behulp van aseptische methoden als hierboven. Gebruik maken van de digitale afbeelding van de hersenen vasculatuur (genomen op de eerste operatie datum) naar de oorspronkelijke beeldvorming locatie te vinden. Opnieuw aan roestvrij staal headplate (stap 10-12). Gebruik een microchirurgische mes om zachtjes weg te dun elk bot dat zou kunnen hebben opnieuw gegroeid tussen de beeldvorming tijdstippen. Indien nodig, dun met tandheelkundige boren. Duidelijke beeldvorming raam van puin en toepassen van een daling van 0,9% steriele zoutoplossing.
26. Carry dier tot twee-foton microscoop en zoek originele beeldvorming veld. Gebruik maken van de digitale foto genomen tijdens de eerste opnamesessie voor hulp.
27. Open het Fluoview programma en open de oorspronkelijke lage vergroting afbeelding. Aanbrengen van een transparant vel op het computerscherm en schets de belangrijkste bloedvat patroon met behulp van een transparant pen.
28. Open de Live image en opnieuw uitlijnen van het bloed vasculatuur om de geschetste patroon op de transparante film.
29. Om Reimage de 8x ingezoomd in structuren, open de gewenste verzameld stack van de vorige opnamesessie. Schets van de structuur (dat wil zeggen axonen, dendritische, gliale) op een transparante film, aangebracht op het computerscherm.
30. Zoom in 8x van de Live Image en zet de pan coördinaten aan de eerste dag imaging parameters. Afhankelijk van de nauwkeurigheid van het uitlijnen van de lage vergroting locatie, kan het noodzakelijk zijn om ook de hoek van het beeld enigszins. Zodra de gewenste structuur gevonden is, overeenkomen met de structuur van uw schetsen een hoge vergrotingsfactor patroon. Verzamel de z-stack met de identieke stap grootte en het aantal z-stack beelden voor latere analyse.
31. Herhaal stap 29 en 30 totdat alle hoge vergrotingsfactor beelden worden opnieuw verzameld.
32. Wanneer beeldvorming is voltooid, herhaalt u de stappen 22-24. Re-imaging kan worden herhaald op maximaal twee aparte tijdstippen.
33. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Vivarium en de afdeling Laboratory Animal Medicine van de Universiteit van Rochester School of Medicine en Tandheelkunde set, in de volledige erkenning door de Vereniging voor de evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care, internationale (AAALAC) en zijn in overeenstemming met de staatswet, federale statuten en NIH beleid.

Representatieve resultaten

In GFP-M uiten muizen, kan een subset van laag 5 piramidale cellen en de bijbehorende dendritische processen eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van twee-foton laser scanning microscopie (2PLSM) ^1. Hier hebben we laten zien een verdunde-schedel preparaat waarin de schedel op de gewenste beeldvorming locatie is uitgedund tot ~ 10-30 pm. Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om duidelijk te visualiseren corticale dendrieten en stekels in het intacte visuele cortex voor acute of chronische analyse (figuur 2).

Figuur 1. Aangepaste kop en voetplaat. (A) Bovenaanzicht van custom made ​​hoofd-en bodemplaat gebruikt voor verdund-schedel chirurgie voorbereiding. (B) Zijaanzicht van custom-made hoofd-en bodemplaat. (C, D) Gedetailleerde schema en het imago van het hoofd plaat.

in vivo in de visuele cortex van een transgene GFP-M muis met behulp van twee-foton microscopie. Beeld is een projectie van een beeld verkregen om de 5 micrometer van de pia tot een uiteindelijke diepte van 175 micrometer. De doos gebied in A staat voor het vergroot gebied in (B) en (C) afgebeeld op dag 0 (D0) en vier dagen later (D4). (D, E) Hogere vergroting van dendritische tak boxed in B en C tonen stabiele stekels (witte pijlpunten), verloren / terug te trekken stekels (rode pijl koppen) en nieuwe stekels (groene pijl koppen). Schaal bars = A. 200 urn, B, C. 20 urn, D, E. 5 micrometer.

Discussion

Chronische beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie is een steeds populairder techniek om morfologische veranderingen ten gevolge gedurende plasticiteit ^2-5 te bestuderen. Hier laten we zien een verdunde-schedel voorbereiding om de geconstateerde dendritische spines in de intacte hersenen van muizen te volgen op verschillende beeldvormende dag. In dit protocol is de schedel intact gelaten, waardoor minimale schade aan de cortex en resulteert in een zeer lage niveaus van ontstekingsprocessen die kunnen functioneren van de hersenen veranderen ^6. Hierdoor kan het dier af te beelden direct na de eerste operatie en dan vervolgens reimaged dagen tot jaren later. Dit is een krachtige techniek, maar heeft ook zijn beperkingen. De meer invasieve venster preparaat dat een craniotomie en dus bijbehorende glia activatie gaat, laat herhalen beeldvorming van de hersenen met een willekeurig aantal beeldvorming sessies, terwijl de craniale venster is duidelijk. De dunne schedel voorbereiding, is echter beperkt tot ten hoogste drie sessies beeldvorming als gevolg van de operatie betrokken zijn bij het openen en sluiten van de muis huid. Bovendien, penetratiediepte is superieur in de craniale venster ^2. Zorgvuldige overweging moeten worden genomen bij de beslissing van de chirurgische aanpak voor chronische imaging experimenten.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12