Summary
Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir protokol
Abstract
Bozulmamış beyin hücreleri ve nöronal süreçleri yaşayan iki foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM) kullanarak in vivo görüntüleme çalışma sağlar. Burada sunulan teknik MSS eksitatör postsinaptik sitelerin büyük çoğunluğu temsil eden küçük yapılar dendritik dikenler izleme izin mikroskobik çözünürlüğü ile çeşitli zaman noktalarında (kronik görüntüleme) aynı bölgede beyin görüntüleme sağlar. Ince kortikal yapıların, birkaç kez puan üzerinden açıkça çözmek için yeteneği, sinapsların morfolojik değişiklikler ve devre remodelling altta yatan mekanizmaların açıklanmasına yardımcı olan beyin plastisite çalışma, özellikle pek çok avantajı vardır. Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik seyrelmiş bir kafatası hazırlık kullanarak bozulmamış beyin in vivo görüntüleme için bir protokol göstermektedir. Inceltilmiş kafatası hazırlama, minimal invaziv bir yaklaşım, böylece bir inflamatuar yanıt başlangıcı azaltarak, dura ve / veya korteks potansiyel zarar görmesini engeller. Bu protokol doğru yapıldığında, açıkça zaman uzun bir süre içinde bozulmamış beyin dendritik omurga özellikleri değişiklikleri izlemek için mümkündür.
Protocol
- Iki foton mikroskopi, nöronlar floresan işaretleri ile etiketlenmiş bir hazırlık kullanarak sağlam beyin nöronları görselleştirmek için kullanılmaktadır. Deneylerde burada sunulan 5 piramidal hücrelerde 1 tabaka etiketler GFP-M transgenik fare hattı kullanıyoruz. Katman 5 piramidal hücreleri pia seviyesinin altında 300 mm derinliğe kadar, dendritler ve dendritik dikenler görselleştirme sağlayarak, yüzeysel katmanlarına dendritik süreçleri proje. Etiket hücrelere viral belirteçlerin (Lowery ve ark, vallahi teslim) kullanarak alternatif bir yaklaşım.
- Aseptik cerrahi için% 70 etanol ve otoklav araçları kullanarak çalışma alanı sterilize edin. Temiz bir sargı ile yüzey işletim örtün.
- Fareler IACUC onaylanmış prosedürlerini kullanarak Avertin çeyrek doz (0,0075 mg / ml) izledi. Fentanil kokteyl (; midazolam 5 mg / kg metatomadin 0.5 mg / kg fentanil 0.05 mg / kg) ile anestezi Analjezik fareler ön işlemden buprenorfin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ). Anestezi uçağın kuyruk / ayak tutam test reaksiyonu ile izleyin.
- 37.5 az hayvan koruyun ° C'ye bağlı rektal termometre ile ısıtma battaniyesi.
- Gözleri gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik merhem sürün. Hood, ameliyat sırasında ışık kaynağı gözleri korumak için küçük kağıt levha ile gözler.
- Makaslar kullanılarak, gözler başın arkasına (kulak arkası) saç kaldırmak.
- Ardışık uygulaması ile% 70 etanol, hayvan kafası üst Temiz, betadin fırçalayın ve betadin çözüm izledi.
- Gözleri orta hat (hangi yarımkürede görüntülü olacak bağlı olarak) ya da sağ veya sol kenarı boyunca, kulakları ve arkasında bir L-kesme kesi olun. Cilt üzerine katlayın ve hemen ameliyat sitesinden. Cilt görüntüleme oturumunun ardından sütüre olacak gibi cilt çıkarmayın.
- Ince forseps kullanımı cildi hafifçe ilgi alanından yukarı çekin ve uzak.
- Yavaşça temiz forseps veya mikrocerrahi bıçak ile kafatası maruz kalan alan periost kazınması. Pamuklu bir bez kullanarak, periost zarı tamamen kuru ve tamamen silinmiş olduğundan emin olmak için% 10 Ferric Chloride kafatasına küçük bir miktar geçerlidir. Kafatası tutkal uygun kalarak (11) sağlamak için tamamen kuru olduğundan emin önemlidir. Forseps veya mikrocerrahi bıçak kullanarak, nazikçe uzak kurutulmuş periost membran kazıyın.
- Siyanoakrilat yapıştırıcı paslanmaz çelik kafa plaka (bkz. Şekil 1) ve yapıştırmayın kafatası plaka görüntüleme penceresi etrafında ince bir tabaka uygulayın.
- Ahşap sonunda bir pamuklu çubukla sopa kullanarak, görüntüleme penceresi içinde dikişler tutkal sürün; görüntüleme plaka ve kafatası eğrilik arasındaki tüm boşlukları doldurmak için emin olun.
- Tutkal hızlandırıcı bir damla pencerenin içine yerleştirin. Çabucak fazla tutkal hızlandırıcı, pamuklu bir bez veya kim silin ile silin. Tutkal tamamen sondaj önce katılaşmış olmalıdır.
- 0.7 mm paslanmaz çelik çapak ile yapıştırılmış bir diş matkap kullanarak görüntüleme penceresi kafatası inceltmek için başlayın. Kafatası üzerinde çok fazla ısı üreten önlemek için zaman zaman% 0.9 'luk steril serum fizyolojik uygulaması ile Alternatif delme.
- Diş delme ile kafatası yüzeyi üzerinde küçük bir vuruş kullanarak kafatası üzerinde ince bir 4x4 mm penceresi. Künt son forseps ile kafatası inceliği sınayın. Kafatası yüzeyinde hafif hafif basınç ile girinti olacak. Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 mikron.
- Kafatası ince ve pencere, tüm enkaz kafatası üzerinde tuzlu yer temizlenmelidir. Fotoğraf diseksiyon kapsamı monte edilmiş bir dijital kamera ile görüntüleme penceresi. Fotoğraf ve beynin damarsal kullanımı sonraki görüntüleme oturumları için görüntüleme plaka yerleştirmek için konumunuzu yardımcı olacaktır.
- 2-foton teçhizat hayvan taşınması. Hayvan tüm görüntüleme oturumu sırasında ısıtıcı battaniye (rektal prob ile) kalmalıdır. Not: sedasyon altında iken, hayvanın temel vücut ısısı kortikal hasar veya ölümle sonuçlanan bir ısıtma ünitesi olmaması büyük dalgalanma olacak.
- Mai Tai lazer, 10W maksimum güç ve modifiye Olympus Fluoview konfokal ünitesi için katı hal pompa ile iki foton mikroskop kullanılır. Sistemi, derin doku görüntüleme için optimize edilmiş ve dış dedektörleri beyin floresan maksimum algılama sağlamak için mümkün olduğunca objektif yakın olarak yüklenir. Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objektif lens kullanılır. % 0.9 serum fizyolojik amacı dalma için görüntüleme sırasında kullanılır.
- Bu mikroskop kullanarak, ve düşük dijital zoom (x1), parlak etiketli nöron içeren bir alan tanımlar.
- Mikroskop göz parçası yapıştırılmış bir dijital kamera kullanarak, görüntüleme alanında bir fotoğraf çekmek. Alternatif olarak, kan damarsal deseni eskiz. Bu yeniden gereklidaha sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konuma çevirin.
- Tüm görünür ölçüde ölçüde dendritik dallanma gösteren beyin (genellikle ~ 200 mm kapsayan) sayesinde, düşük bir büyütme yığını (5 mikron adım x20 amacı, 512x512 piksel) edinin. Not: Bu düşük büyütme görüntü, hem kan damarları ve dendritler genç ve yetişkin hayvanların kendi yapısını korumak, daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme alanını bulmak için kullanılacaktır.
- Görüntüleme yazılımı (Fluoview, v. 5.0, FV300) kullanarak, 8 kat dijital büyütme oranını artırın. X, Y koordinatları (tava koordinatları), gerekirse ayarlayın ve konumları ve dendritik dikenler yapısı da dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfoloji gösteren bir yüksek büyütme yığını toplamak. Her yığın toplanması, yani pan koordinatlar, toplanması, yığın içinde adım adım z boyutu ve sayısı aralığı ile ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar bir sonraki zaman noktasında bu dendrit ve akson dönerken kullanılacaktır.
- Görüntüleme ardından, kafatası yüzeyinden yavaşça plaka ayırarak kafa plaka kaldırmak. Forseps kullanarak, kafatası üzerinde kalan herhangi bir kalıntı tutkal kaldırmak ve% 0.9 'luk steril serum fizyolojik ile kafatası yüzeyi silin. # 6 sütür iplik kullanarak birlikte kafatası üzerinde deri dikin. % 70 etanol ile alanı silin. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ağrı hafifletmek için, 0.1 mg / kg Buprenorfin analjezik, SQ yönetmek.
- Bir ısı lambası altında temiz bir kafes yerleştirin hayvan uyanır ve mobil kadar. Orijinal kafes hayvan dönün.
- Daha sonraki bir zaman noktasında (2 gün dışında birçok ay görüntüleme zaman noktalarında herhangi bir yerde olabilir) Reimage hayvan için, dikiş kaldırmak ya da yukarıdaki gibi aseptik yöntemler kullanarak kafasına cilt yeniden. Orijinal görüntüleme konumu için beynin damarsal (ilk cerrahi tarihinde alınan) dijital görüntü kullanın. Reaffix paslanmaz çelik headplate (adım 10-12). Yavaşça herhangi bir kemik görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilir uzakta ince bir mikrocerrahi bıçak kullanın. Eğer gerekli diş matkap ile ince. Clear görüntüleme enkaz pencere ve% 0.9 'luk steril tuzlu bir damla uygulayın.
- Iki foton mikroskop hayvan Carry ve orijinal görüntüleme alanını bulun. Yardım için ilk görüntüleme oturumu sırasında alınan dijital fotoğraf kullanın.
- Fluoview programını açın ve orijinal düşük büyütme görüntüyü açmak. Yapıştırmayın bilgisayar ekranında ve kroki için bir saydamlık sayfalık bir saydamlık kalem kullanarak büyük bir kan damarı desen.
- Canlı görüntü açın ve asetata çizilen desen kan damarsal realign.
- Yapılarda yakınlaştırılmış 8x Reimage için, bir önceki görüntüleme oturumda istenilen toplanan yığın açın. Bilgisayar ekranına yapıştırılan yapısı (glial, dendritik, yani akson), asetat film üzerine çizin.
- Canlı Görüntü 8x zoom ve pan ilk gününde görüntüleme parametrelerine koordine eder. Düşük büyütme yeri hizalayarak doğruluğunu bağlı olarak, o da biraz görüntü açısını ayarlamak için gerekli olabilir. Istenilen yapısı tespit edildikten sonra, kabataslak yüksek büyütme desen yapısı kadar maç. Z-yığın, sonraki analiz için z-yığın görüntüleri aynı bir adım boyutu ve sayısı ile toplayın.
- Tüm yüksek büyütme görüntüleri yeniden toplanana kadar 29 ve 30 adımları tekrarlayın.
- Görüntüleme işlemi tamamlandığında, tekrar adımları 22-24. Re-görüntüleme, 2 ayrı zaman noktalarında tekrar edilebilir.
- Hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından tam akreditasyon Vivarium ve University of Rochester Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi Laboratuar Hayvanları Tıp Bölümü tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak yapıldı International (AAALAC) ve eyalet yasası, federal tüzüğü ve NIH politikası ile uyum içinde.
Temsilcisi Sonuçlar
GFP-M ifade farelerde, bir alt katman 5 piramidal hücreleri ve buna karşılık gelen dendritik süreçleri 2-foton lazer tarama mikroskobu (2PLSM 1) kullanarak kolayca görüntülenebilmekte olabilir. Burada istenen görüntüleme konumu üzerinde kafatası ~ 10-30 mikron inceltilmiş olduğu seyrelmiş bir kafatası hazırlık gösterdi. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize açıkça, akut ya da kronik analizi (Şekil 2) için sağlam görsel korteksteki kortikal dendritler ve dikenler görselleştirmek için izin verdi.
Şekil 1. Özel baş ve taban plakası inceltilmiş-kafatası cerrahisi hazırlanması için kullanılan özel yapılmış baş ve taban plakası (A) Üstten görünüm. Ölçüye baş ve taban plakası (B) Yan görünüm. (C, D), kafa plaka detaylı şematik ve görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Iki foton mikroskopi kullanılarak Kronik görüntüleme plastisite 2-5 sırasında tetiklenen morfolojik değişiklikleri incelemek için giderek daha popüler bir teknik haline gelmektedir . Burada farklı görüntüleme gün bozulmadan fare beyin tespit dendritik dikenler takip seyrelmiş bir kafatası hazırlık göstermektedir. Bu protokolde, korteks minimal hasara neden kafatası ve beyin fonksiyonu 6 değiştirebilir nöro çok düşük seviyelerde ile sonuçlanan, değişmeden kalır. Bu hayvan, ilk cerrahiden hemen sonra ve ardından daha sonraki yıllarda sonradan reimaged gün imaged olanak sağlar. Bu, güçlü bir teknik değil, aynı zamanda kendi sınırlılıkları vardır. Kafatası penceresi açık iken bir kraniotomi ve dolayısıyla ilişkili glial aktivasyon gerektirir daha invaziv pencere hazırlanması, beyin görüntüleme oturumları keyfi bir sayı ile tekrar görüntüleme sağlar. Ince kafatası hazırlık Ancak, fare cilt açılış ve kapanış ilgili ameliyat nedeniyle en az üç görüntüleme oturumları ile sınırlı. Ayrıca, derinlemesine nüfuz kraniyal pencere 2 üstün. Kronik görüntüleme deneyleri için cerrahi yaklaşım, karar verirken Bu nedenle dikkatli dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler (AKM) Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü tarafından desteklenen, Whitehall Vakfı Araştırma Bursu (AKM), Sloan Vakfı Bursu (AKM), NIH EY019277 (AKM) ve bir NEI tarafından finanse edilen, Vizyon Eğitim Grant, EY013319 ( EAK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
|||
| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
|||
| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
