Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Summary

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la crónica

Abstract

Imágenes in vivo utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (2PLSM) permite el estudio de las células vivas y los procesos neuronales en el cerebro intacto. La técnica que aquí se presenta permite que la imagen de la misma área del cerebro en varios puntos del tiempo (crónica de imágenes) con resolución microscópica que permite el seguimiento de las espinas dendríticas, que son las pequeñas estructuras que representan la mayoría de los sitios postsinápticos excitatorios en el SNC. La capacidad de resolver bien claramente las estructuras corticales más de varios puntos del tiempo tiene muchas ventajas, especialmente en el estudio de la plasticidad del cerebro en la que los cambios morfológicos en las sinapsis y la remodelación del circuito puede ayudar a explicar los mecanismos subyacentes. En este material de vídeo y complementarias, se muestra un protocolo para la crónica en vivo de imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo. La preparación diluida-cráneo es un método mínimamente invasivo, lo que evita posibles daños a la duración y / o la corteza, lo que reduce la aparición de una respuesta inflamatoria. Cuando este protocolo se realiza correctamente, es posible seguir con claridad los cambios en las características de la espina dendrítica en el cerebro intacto durante un período prolongado de tiempo.

Protocol

1. Para visualizar las neuronas en el cerebro intacto utilizando microscopía de dos fotones, una preparación donde las neuronas son etiquetados con marcadores fluorescentes se utiliza. En los experimentos que aquí se presenta se utiliza la línea de las buenas prácticas agrarias-M de ratones transgénicos que las etiquetas de la capa de células piramidales 5 ^1. Capa 5 células piramidales proyecto prolongaciones dendríticas en las capas superficiales, lo que permite la visualización de las dendritas y espinas dendríticas hasta una profundidad de 300 m por debajo del nivel de la PIA. Un enfoque alternativo es a las células de la etiqueta utilizando los marcadores virales (véase Lowery et al., Presentado a JOVE).
2. Esterilizar el área de trabajo con 70% de etanol y las herramientas de autoclave para la cirugía aséptica. Cubrir la superficie de operación con vendaje limpio.
3. Anestesiar a los ratones con un cóctel de fentanilo (fentanilo 0,05 mg / kg, midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg), seguido de una dosis de la cuarta parte de Avertin (0,0075 mg / ml), utilizando IACUC los procedimientos aprobados. Tratamiento previo a los ratones con el analgésico, la buprenorfina (0,5 mg / kg) administrada por vía subcutánea (SQ). Controlar el nivel de plano anestésico por la reacción de pruebas para pellizcar la cola / dedo del pie.
4. Mantener los animales a 37,5 ° C con una manta de calentamiento con un termómetro rectal adjunto.
5. Aplique un ungüento oftálmico para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Ojos Hood con hoja de papel para proteger los ojos de la fuente de luz durante la cirugía.
6. Con la tijera, quitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (detrás de las orejas) en los ojos.
7. Limpie la parte superior de la cabeza del animal con la aplicación secuencial de etanol al 70%, seguido de lavado y la solución de betadine betadine.
8. Hacer una incisión en L-por detrás de las orejas y hasta por el lado derecho o izquierdo de la línea media (dependiendo de en qué hemisferio se creará una imagen) a los ojos. Pliegue de la piel sobre y fuera del lugar de la cirugía. No quite la piel, la piel se sutura después de la sesión de imágenes.
9. Con unas pinzas finas tire suavemente de la piel hacia arriba y lejos de su área de interés.
10. Raspar suavemente el periostio de la zona expuesta de cráneo con unas pinzas o una hoja limpia de microcirugía. Utilizando un hisopo de algodón, aplique una pequeña cantidad del 10% de cloruro férrico en el cráneo que se seque completamente la membrana periostio y asegurarse de que se ha eliminado por completo. Es importante que el cráneo está completamente seco para asegurar la adhesión adecuada de la cola (ver 11). El uso de fórceps o una hoja de microcirugía, raspar suavemente lejos de membrana seca periostio.
11. Aplique una capa fina de pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana de imagen de la placa de acero inoxidable de la cabeza (ver Figura 1) y fijar la placa en el cráneo.
12. Con el extremo de un palo de madera, algodón, esponja, aplique el pegamento en las costuras en el interior de la ventana de imagen, asegurándose de llenar todos los huecos entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo.
13. Coloque una gota de pegamento en el acelerador de la ventana. Rápidamente borrar acelerador de exceso de pegamento con un hisopo de algodón o kim limpiar. El pegamento debe ser completamente solidificado antes de perforar.
14. Comiencen a perder masa del cráneo en la ventana de imagen usando un taladro dental identificado con una de 0,7 mm de acero inoxidable fresa. Perforación se alternan con la aplicación ocasional de 0,9% solución salina estéril para evitar que se genere un exceso de calor en el cráneo.
15. Delgada ventana de 4x4 mm en el cráneo con movimientos pequeños en toda la superficie del cráneo con un taladro dental. Prueba de la delgadez de la cabeza con unas pinzas de extremos romos. La superficie del cráneo guión un poco con una suave presión. El grosor del cráneo óptimo para la imagen es de entre 10 y 30 micras.
16. Cuando el cráneo es fina y limpia la ventana de todos los desechos, el lugar de solución salina en el cráneo. Fotografía de la ventana de imagen con una cámara digital montada en un microscopio de disección. La fotografía y el uso de la vasculatura del cerebro que ayuda a localizar la posición de colocar la placa de imagen para las sesiones de formación de imágenes posteriores.
17. Transporte de los animales a la plataforma de 2 fotones. El animal debe permanecer en la manta térmica (con sonda rectal) durante la sesión de las imágenes. Nota: mientras que en la sedación, la temperatura del animal corporal fluctúa mucho en la ausencia de una unidad de calentamiento que resulta en daño cortical o incluso la muerte.
18. Un microscopio de dos fotones con un láser Mai Tai, una bomba de 10 W en estado sólido de potencia máxima y una modificación de Olympus unidad Fluoview confocal se utiliza. El sistema está optimizado para obtener imágenes de tejidos profundos y detectores externos se instalan tan cerca del objetivo como sea posible para permitir la detección de la fluorescencia máxima desde el cerebro. Una Olympus LUMPlan fl / IR lente objetivo 20X/0.95NA se utiliza. 0,9% se utiliza durante la exploración para el objetivo de inmersión.
19. El uso de este microscopio, y un zoom digital de bajo (x1) identificar un área que contiene las neuronas brillantes etiquetados.
20. Utilizando una cámara digital colocada en el microscopio ocular, tomar una fotografía de la superficie de imágenes. Por otra parte, esbozar el patrón de vasos sanguíneos. Esto es necesario para volver aa su vez a la ubicación de imágenes en un mismo punto de tiempo posterior.
21. Obtener una pila de bajo aumento (objetivo x20, 512x512 píxeles, 5 m paso) a través de toda la extensión visible del cerebro (generalmente durante ~ 200 micras) que muestra el grado de ramificación dendrítica. Nota: esta imagen bajo aumento se utiliza para localizar el área de la imagen en puntos de tiempo posteriores que tanto los vasos sanguíneos y las dendritas mantener su estructura en los animales jóvenes y adultos.
22. Usando software de imagen (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentar la ampliación digital de 8 veces. Ajustar la coordenadas X, Y (pan coordenadas) y si es necesario recoger un montón de gran aumento que muestra la morfología detallada dendríticas incluyendo la ubicación y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre cada colección de pila, es decir, pan coordenadas, la gama de la colección, el tamaño de z a paso y el número de pasos en la pila. Estas notas se utilizarán al regresar a esta dendrita o axón a un tiempo posterior.
23. Siguiente imagen, retire la placa de la cabeza con cuidado separar la placa de la superficie del cráneo. Con unas pinzas, quite cualquier adhesivo residual que queda en el cráneo y limpiar la superficie del cráneo con el 0,9% de solución salina estéril. Suturar la piel sobre el cráneo, usando # 6 hilo de sutura. Limpie el área con el 70% de etanol. Para aliviar el dolor durante la recuperación post-operatoria, la administración de 0,1 mg / kg analgésico buprenorfina, SQ.
24. Lugar de los animales en la jaula de limpiar debajo de una lámpara de calor hasta que se despierta y es móvil. Volver a la jaula de los animales originales.
25. Para crear la imagen de los animales en un momento posterior (los puntos de una imagen en tiempo puede variar de 2 días a varios meses de diferencia), sacar los puntos o volver a abrir la piel de la cabeza utilizando métodos asépticos que el anterior. El uso de la imagen digital del cerebro vascular (tomadas en la fecha la primera cirugía) para localizar la ubicación de imagen original. Reaffix de acero inoxidable headplate (pasos 10-12). Utilice una hoja de microcirugía para adelgazar suavemente lejos cualquier hueso que podría haber crecido de nuevo entre los puntos de una imagen en tiempo. Si es necesario, delgado, con taladro dental. Ventana de imágenes libres de escombros y aplicar una gota de solución salina 0,9% estéril.
26. Llevar animales a la de dos fotones microscopio y localizar campo de la imagen original. Usa la fotografía digital tomada durante la sesión de imágenes de primera ayuda.
27. Abra el programa Fluoview y abrir la imagen original bajo aumento. Coloque una hoja de transparencia a la pantalla de la computadora y dibujar el patrón de los vasos sanguíneos principales utilizando una pluma de transparencia.
28. Abra la imagen en vivo y realinear los vasos sanguíneos con el modelo esbozado en la película de transparencia.
29. Para crear la imagen del zoom de 8x en las estructuras, abrir la pila deseada recogidos de la sesión de imágenes anteriores. Dibuje la estructura (es decir, axonal, dendríticas, gliales) en una película de transparencia, colocada en la pantalla del ordenador.
30. Zoom 8x de la imagen en vivo y ajustar el panorama coordenadas para los parámetros de imagen del primer día. Dependiendo de la exactitud de la alineación de la ubicación de bajo aumento, puede ser necesario ajustar también el ángulo de la imagen un poco. Una vez que la estructura deseada se encuentra, coinciden con la estructura de su patrón esbozado una gran ampliación. Recoger el z-stack con el tamaño del paso idénticos y el número de z-stack imágenes para su posterior análisis.
31. Repita los pasos 29 y 30 hasta que todas las imágenes de gran aumento se recojan.
32. Cuando la imagen está completa, repita los pasos 22-24. Nueva imagen se puede repetir en un máximo de 2 puntos de tiempo separados.
33. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Vivarium y la División de Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Rochester, Facultad de Medicina y Odontología, en plena acreditación por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio, Internacional (AAALAC) y están en conformidad con la ley estatal, la legislación federal y la política de NIH.

Resultados representante

En las buenas prácticas agrarias-M ratones que expresan, un subconjunto de la capa de células piramidales y 5 correspondientes procesos dendríticas pueden ser fácilmente visualizados usando 2-fotón microscopía de escaneo láser (2PLSM) ^1. Aquí hemos demostrado una preparación diluida, en el cráneo que se adelgaza el cráneo sobre la ubicación de imagen deseada a ~ 10-30 micras. Se realiza correctamente, el protocolo nos permite visualizar claramente las dendritas corticales y las espinas en la corteza visual intacto para el análisis agudo o crónico (Figura 2).

Figura 1. Cabeza de la costumbre y la placa base. (A) Vista superior de la cabeza por encargo y la placa base que se utiliza para la preparación de la cirugía cráneo-diluido. (B) Vista lateral de la cabeza a medida y la placa base. (C, D) esquemática detallada y la imagen de la placa de la cabeza.

en vivo en la corteza visual de un transgénico GFP-M ratón usando la microscopía de dos fotones. La imagen es una proyección de imagen individuales obtenidos cada 5 m de la pia a una profundidad final de 175 micras. El área de caja en una representa a la región ampliada en (B) y (C) fotografiado en el día 0 (D0) y cuatro días más tarde (D4). (D, E) Mayor aumento de la rama dendríticas en caja de B y C que demuestran espinas estable (cabezas de flecha blanca), perdido / espinas retracción (cabezas de flecha roja) y nuevas espinas (cabezas de flecha verde). Las barras de escala = A. 200 micras, B, C. 20 m, D, E. 5 micras.

Discussion

Imágenes crónica utilizando microscopía de dos fotones se está convirtiendo en una técnica cada vez más popular para estudiar los cambios morfológicos se dispararon durante ^2-5 plasticidad. Aquí se demuestra una preparación diluida-cráneo de seguir identificado las espinas dendríticas en el cerebro del ratón intacto en día imágenes diferentes. En este protocolo, el cráneo se deja intacta, causando el mínimo daño a la corteza y que resulta en niveles muy bajos de la neuroinflamación que pueden alterar la función cerebral ^6. Esto permite que el animal para ser captado inmediatamente después de la cirugía y luego días después reimaged que años más tarde. Esta es una técnica poderosa, pero también tiene sus limitaciones. La preparación de la ventana más invasiva que consiste en una craneotomía y por lo tanto, la activación asociada gliales, permite repetir imágenes del cerebro con un número arbitrario de sesiones de formación de imágenes, mientras que la ventana del cráneo es clara. La preparación del cráneo delgadas, sin embargo, se limita a un máximo de tres sesiones de formación de imágenes debido a la cirugía realizada en la apertura y el cierre de la piel del ratón. Además, la profundidad de penetración es superior en la ventana de ² craneal. Una consideración cuidadosa por lo tanto, se deben tomar al momento de decidir el abordaje quirúrgico para los experimentos de imagen crónica.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12