Summary
여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.
Abstract
두 광자 (2P) 현미경은 생물학에 의해 광범위하게 적응되어 고해상도 이미징 기술이다. 2P 현미경의 가치는 그대로 조직 내에서 라이브 생쥐의 세포 행동에 관한 풍부한 spatiotemporal 정보를 제공한다는 것입니다. 백혈구 모집 호스트 감염에 대한 방어와시 선택하지에 큰 역할을, 염증 및 면역 질환에 기여하실 수 있습니다. 세포가 빛을 산란 조직 내에 깊이있는 혈관 내에 빠르게 이동되므로 생체내에서 백혈구 채용을 공부하는 것은 기술적으로 도전합니다. 지금까지 대부분의 intravital 영상 연구는 혈관과 조직을 노출 외과 준비가 필요합니다. 수술 자체 유도 조직 손상과 염증을 방지하려면 여기, 우리는 마우스 노상 강도 및 지골에서 백혈구 거래를 연구하는 데 사용할 수있는 비침습 단일 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 2P 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.
Protocol
1. 동물 준비 :
이 프로토콜은 neutrophils과 macrophages이 찬란 eGFP 1의 표현에 의해 표시하는, 성인 여성 성인 LysM - eGFP 마우스를 사용합니다.
- 혈관에 레이블 :
비 타겟 양자 도트의 15μl 혈관을 시각화하는 (655nm) PBS 100 μl에 희석 및 이미징하기 전에 마우스를 10-30 분에 정맥 주입합니다. - 마취 :
- 수의과 흡입 마취 시스템 (귀족 의료 서비스, 병원)의 유도 챔버에서 마우스를 놓습니다.
- Isoflurane 3~4%하고 100 % 산소 캐리어 가스 유량에 기화기를 설정 ~ 1 L / 분. 후면 발가락 핀치 반사가 손실 때까지 실수 마취의 과용을 방지하기 위해 밀접하게 동물을 모니터링합니다.
- 마취는 1.5에서 관리하고 있습니다 필요에 따라 호흡 유물을 최소화하기 위해 영상 중에 조정 ~ 2% Isoflurane 및 괜찮아요. 마우스의 호흡 속도는 마취의 적절한 비행기를 확보하기 위해 이미징 세션에 걸쳐 신중하게 모니터링합니다.
- Puralube 수의과 연고가 건조 방지하기 위해 눈을에 적용됩니다.
- 마우스는 규제 36에 배치됩니다 ° C 가열 패드 (브레인 트리 과학) 주입 및 이미징 도중 저체온증을 방지하기 위해.
- 탈수 방지하기 위해 마우스 PBS SC 모든 1~2시간 100 μl 주어집니다.
- 백혈구 채용을 유발하는 염증성 자극을 제공합니다 :
- 수술 단계와 면봉 70 %의 에탄올과 노상 강도에 마우스를 놓습니다.
- ~ 90 도의 분사를 촉진하고 배달 깊이의 정밀도를 향상시키기 위해 베벨 근처 인슐린 주사기 바늘을 구부.
- 1μl PBS에 희석 bioparticles E.coli 0.5 μg과 주사기를로드합니다. 이것은 쉽게 비말을 로드할 수 있도록 microfuge 튜브의 뚜껑에 할 수 있습니다.
- 굽은 집게로 발가락을 잡고 그것이 바로 피부 아래까지 베벨이 위를 향하게과 피부를 통해서 부드럽게 바늘을 삽입합니다.
- 천천히 주입하고 다시 물을 방지하기 위해 5 초 동안 장소에서 개최.
2. 이미징 단계 설정 :
영상 플랫폼은 센터를 통해 절단 원형 구멍이있는 알루미늄 플레이트로 구성되어 있습니다. 대형 커버 유리 접시와 고무 O - 링이 뒤쪽 발을 수용하기 위해 방수 recessed 챔버를 만드는 상단에 붙어 있습니다 하단에 붙어있다. 알루미늄 플레이트가 36 ° C 접시 상단에 부착된이 가열 요소를 통해 따뜻하게합니다.
- 사전 예열 영상 무대에서 마우스를 놓고 36 ° C의 온난 패드를 사용하여 마우스의 핵심 체온을 유지합니다.
- superglue의 박막으로 이미징 챔버의 coverglass에 앞발을 고정합니다.
- 두 접착제의 부동 비트를 제거하고 신선한 PBS (° C 36 미리 예열)와 챔버를 채우기 위해 앞발을 씻으십시오.
생쥐는 동물의 생존을 구성하지 않고 최대 4 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 발을 부드럽게 아세톤 및 세로 이미징 연구 소생 생쥐의 작은 양의 공개 수 있습니다. 그러나,이 경우, 우리는 <2 시간 이미징 기간을 권장하고 마취의 과다 복용이나 탈수의 위험을 최소화하기 위해 세션 사이 24-48 H를 기다리고 있습니다.
3. 이미징 취득
이 프로토콜에서 사용되는 두 개의 광자 현미경 (2P 현미경)는 똑바로 현미경 구성된 맞춤식 듀얼 레이저 비디오 속도 시스템입니다. 이 시스템은 두 개의 티를 갖추고 있습니다 : 사파이어 레이저, 넷 정면에서 동시에 3, 4 채널 인수 및 20x 물 침지 목표 (올림푸스, 20x/0.95 NA)에 대한 이중 알칼리 PMTs.을
- 890 - 900nm에 사파이어 레이저 (일관된 주) : 카멜레온 XR 티를 조정.
- 파란 (<480 nm의 두번째 고조파 생성 신호), 녹색 (480 - 560nm, LysM - eGFP 긍정 neutrophils)과 빨간색 (> 560 nm의, 양자 도트 표시 혈관 세 채널을 분리하는 480nm와 560nm 이색성 거울 (SemRoc)를 사용 ). 또는 560nm 필터는 E.을 구분하는 570nm 필터를 교체할 수 있습니다 655nm 양자 점 (적색 깊이가 나타납니다)에서 대장균의 bioparticles (576nm bioparticles 오렌지가 나타납니다.)
- 조심스럽게 PBS에 목적을 절감하고 발가락의 혈관에 중점을두고 있습니다.
- 이미지 수집 속도 비디오 속도 (30f/sec)에서 운영하고 조직 랜드마크로 신속하게 관심의 혈관 (하나를 찾을 수 (비디오 속도 수집 속도) 조직을 조사 콜라겐에서 냄새가 나는데 두 번째 고조파 신호를 이용한 보이는 lysM - eGFP의 neutrophils 포함).
- (수 색상 분리를 최적화하고 배경을 통해 충분한 신호를 달성하는 데 필요한 레이저의 양을 최소화하기 위해 PMTs의 게인을 조정주의 이미지를 포화하지!).
- 관심 지역 지역이있는되면, 시간 저속 영상을 시작합니다. 시간 저속 영상은 두 개의 서로 다른 시간적 해상도로 수행할 수 있습니다. 이미징 세포 압연 및 접착 및 혈관 내에서 실시간으로, 우리는 하나의 Z - 비행기에서 30f/sec을 획득. 실질의 세포 넘쳐 흐름 및 마이 그 레이션을 문서화 위해 우리는 3 차원 시간 저속 이미징을 수행합니다. 전형적인 수집 프로토콜은 각각의 Z - 단계 15 프레임 평균 30 초 간격으로 Z - 단계 200-225 50μm의 볼륨에 대해 21 순차 2.5μm 인수로 구성됩니다.
- 일단 데이터 파일이 실험실 서버에 저장되며, Imaris 또는 Volocity 소프트웨어는 2 추적 다차원 렌더링과 셀, 3을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 대표 결과
호중구의 상상 1.Real 시간 (30f/sec)는 200x에있는 혈관을 따라 굴러. 시간 경과 영상은 빨간색으로 표시된 리스테리아 monocytogenes와 감염 후 상업 중심지에 대한 혈관의 내피 놀면서, 녹색, neutrophils를 보여줍니다. 결합 조직의 콜라겐 섬유가 파란색으로 표시됩니다. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
200x에서 호중구 모집 역학 2.Time - 저속 3D 영상. 염증 조직을 통해 유통 및 마이 그 레이션에서 전형적인 호중구 모집이 나타납니다. 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 비디오 프로토콜에서 우리는 염증에 대한 응답으로 백혈구 모집의 비침습 2P 이미징을위한 절차를 보여줍니다.
노상 강도는 알레르기, 감염 및 면역 질환 4-7로 염증을 공부에 대한 고전적인 생리적 사이트입니다. 2P 영상은 압연 및 이펙터 기능의 사이트에 chemotaxis하는 혈관에 접착에서 백혈구 매매 경로의 별개의 단계에 대한 자세한 그림을 제공합니다. 우리는 백혈구 모집은 염증성 자극의 종류에 대응 다릅니다 것으로 나타났습니다. 자극의 복용은 신중하게 선택된 모든 시도는 생리 모욕을 요점을 되풀이하다을하여야한다. 복용량이 너무 높거나 아닌 생리적 사이트에 전달되면 자극이 실험 유물에 호스트 또는 리드를 압도하고 비정상적인 현상을 생산 수 있습니다. 우리는 적절한 제어와 결합하여 제공되는 볼륨과 주사의 깊이 모두의 정밀도를 높이기 위해 구부러진 바늘을 사용하는 시범 실험을위한 자극의 titrated 복용을 권장합니다. 그것은 연쇄 이미징 실험도 주사의 사이트를 쉽게 찾을 수 있습니다 그것 중요합니다. 이것은 특정 위치 (즉, 두번째 오른쪽 뒷다리 발 세 번째 발가락에 자리)에 주입하거나 피부를 문신하고 인근에 주사하여 수행할 수 있습니다.
2P 영상은 백혈구 매매 및 생체내의 이펙터 기능을 시각화하는 독특한 기회를 제공합니다. intravital 이미지의 대부분은 anesthetized 쥐 80-10의 조직과 혈관을 노출하는 수술을 필요로 백혈구 채용을 연구하는 데 사용되는 방식. 수술 자체는 백혈구 행동에 영향을 것입니다 염증을 유도. 그러나, 2P 영상은 leukocytes가 아닌 invasively 및 기본 3D 조직 환경 내에서 깊은 단일 셀 해상도에서 공부 수 있습니다. 또한, 이미징 절차 이후 자체가 마우스를 해가되지 않는, 그것은 암, 관절염의 모델에 대한 종단 연구를 수행하기위한 탁월한 선택입니다. 2P 영상은 해상도, 각 동물의 주제 내의 모든 사람에게 제공하고 질병 개시 및 진행에서 질병 과정의 전례 볼 수있는 가능성이있다. 이 방법은 세포 감염에 면역성이 어떻게이 같은 반응이 부적절하게 규제하는 경우, 염증 및 면역 질환으로 이어질 수 있습니다 기초 세포와 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기위한 가치있는 도구입니다. 궁극적으로 생체내에서 백혈구 동작에 대한 자세한 사진은 염증 및 감염증 치료를위한 새로운 치료제의 개발에 도움이됩니다.
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Disclosures
모든 실험은 세인트 루이스에있는 워싱턴 대학의 동물 연구위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 그랜트 R01 - 3155-53502 워싱턴 대학 화이자 바이오 메디컬 연구 계약에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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