Summary
Здесь мы описываем неинвазивных двухфотонного (2P) микроскопии подход к изучению лейкоцитов самонаведения в пятом мыши. Мы обсуждаем технические аспекты нашей подготовки изображений тканей и ходить читателя через типичном эксперименте от первоначального созданной для коллекции исполнения и данных.
Abstract
Двухфотонное (2P) микроскопии высокой техникой визуализации резолюции, который был широко адаптирован биологов. Значение 2P микроскопии является то, что он обеспечивает богатую пространственно-временной информации о ячейке поведения в пределах здоровых тканей, и в живых мышей. Лейкоцитов вербовки играет важную роль в защите организма от инфекции, и когда не остановить, может внести вклад в воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Изучение лейкоцитарной вербовки в естественных условиях является технически сложным поскольку клетки быстро движется внутри сосудов, расположенных глубоко внутри тканей светом рассеяния. На сегодняшний день большинство прижизненных изображений исследования требуют хирургического подготовки подвергать кровеносных сосудов и тканей. Чтобы избежать повреждения тканей и воспаления индуцированные самой операцией, здесь мы опишем неинвазивных одноклеточных изображений подход, который может быть использован для изучения лейкоцитов торговли пяте мыши и фаланг пальцев. Мы обсуждаем технические аспекты нашей подготовки изображений 2P и ходить читателя через типичном эксперименте от первоначального созданной для коллекции исполнения и данных.
Protocol
1. Животное подготовки:
Этот протокол использует взрослая самка взрослые LysM-EGFP мышей, в которой нейтрофилы и макрофаги флуоресцентно меченных по выражению EGFP 1.
- Маркировка сосудов:
Для визуализации сосудов, 15μl которые не являются целью квантовых точек (655nm) разводят в 100 мкл PBS и вводили внутривенно мыши 10-30 минут до съемки. - Анестезия:
- Наведите в индукции палаты ветеринарной системе анестезии ингаляции (Noble медицинской службы, Inc).
- Установите испаритель до 3-4% изофлюрана и 100% кислород Расход газа-носителя до ~ 1 л / мин. Для предотвращения случайной передозировки наркоза, внимательно следить за животным до задних ног рефлекс щепотку теряется.
- Анестезия поддерживается на уровне 1,5 ~ 2% изофлюрана и на точно выверенных во время съемки, чтобы минимизировать артефакты дыхания по мере необходимости. Дыхание скорость мыши под тщательным наблюдением всей изображений сессии с целью обеспечения адекватного плоскости анестезии.
- Puralube ветеринарных Мазь наносят на глаза для предотвращения высыхания.
- Мыши помещается на регулируемом 36 ° C грелку (Braintree Научно) во время инъекций и обработки изображений и, чтобы предотвратить переохлаждение.
- Чтобы избежать обезвоживания, мыши дается 100 мкл PBS подкожно каждые 1-2 часа.
- Доставка воспалительные стимулы, чтобы побудить лейкоцитов набора:
- Наведите на сцене хирургии и тампоном подушечку с 70% этанола.
- Согните иглу шприца инсулина ~ 90 градусов около конические для облегчения инъекции и повышения точности доставки глубину.
- Нагрузка шприц с 0,5 мкг E.coli bioparticles разводят в 1 мкл PBS. Это можно сделать в крышке микроцентрифужную трубку, чтобы облегчить нагрузку на капли.
- Держите ноги с изогнутыми щипцами и вставить иглу осторожно через кожу с коническими вверх, пока он находится чуть ниже кожи.
- Вводите медленно и удерживать на месте в течение 5 секунд, чтобы предотвратить обратный поток.
2. Изображениями этап установки:
Платформа визуализации состоит из алюминиевой пластины с круглым отверстием прорезать центра. Большая стеклянная крышка приклеивается к нижней пластине и резинового кольца наклеивается на вершине, чтобы создать жидкостью плотно встраиваемые камеры для размещения задние лапы. Алюминиевую пластину нагревают до 36 ° С с помощью двух нагревательных элементов крепится к верхней пластины.
- Место мыши на подогретого визуализации сцены и поддерживать основные мыши температуры тела использованием 36 ° С потеплением площадку.
- Безопасные лапу покровного стекла из изображений камера с тонким слоем суперклея.
- Вымойте лапу два раза, чтобы удалить любые плавающие биты клей, а затем заполнить камеры со свежим PBS (предварительно нагревают до 36 ° С).
Мыши могут быть отображены на срок до 4 часов, не включающий жизнеспособность животных. Пешком, могут быть освобождены мягко с небольшим количеством ацетона и мышей возродил для продольного исследования изображений. Однако в этом случае мы рекомендуем изображений период до <2 часов и ждут 24-48 ч в период между сессиями, чтобы минимизировать риск передозировки наркоза или обезвоживания.
3. Приобретение изображений
Двухфотонного микроскопа (2P микроскоп), используемые в данный протокол на заказ двойным лазерным видео-курс система, состоящая прямой микроскоп. Система оснащена двумя Ti: Sapphire лазеры, четыре лобовое Би-щелочного ФЭУ для одновременного канал 3 и 4 приобретений и 20-кратным погружения в воду цель (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Tune Chameleon XR титан-сапфирового лазера (Coherent Inc) к 890-900нм.
- Используйте 480nm и 560nm дихроичных зеркал (SemRoc), чтобы отделить три канала: синий (<480 нм, второй гармоники сигнала поколения), зеленый (480-560nm, LysM-EGFP положительные нейтрофилов) и красный (> 560 нм, квантовая точка помечены кровеносных сосудов ). Кроме того, 560nm фильтр может быть заменен на 570nm фильтр отличить Е. кишечной bioparticles (576nm bioparticles появится оранжевый) от 655nm квантовых точек (появится темно-красный).
- Осторожно опустите цель в PBS и сосредоточиться на судно ног.
- Со скоростью получения изображений, работающих на видео-курс (30f/sec) и используя второй гармоники сигнала, исходящих из коллагена ткани ориентир, быстро исследование ткани (на видео-курс приобретения скорости), чтобы найти кровеносных сосудов интереса (один с видимыми lysM-EGFP нейтрофилов).
- Отрегулируйте прибыль от ФЭУ оптимизировать цветоделения и свести к минимуму количество лазерных, необходимых для достижения достаточной сигнала над фоном (бытьосторожны, чтобы не насыщать изображение!).
- Как только область интересов региона находится, начинаются покадровой съемки. Покадровый изображений может быть выполнена с двумя разными временным разрешением. Для визуализации подвижного клеток и адгезии и в режиме реального времени в пределах кровеносных сосудов, мы приобретаем 30f/sec в одной г-плоскости. Для документирования экстравазации клеток и миграции в паренхиме мы выполняем 3D покадровой съемки. Типичный протокол приобретения будет состоять из 15 кадров в среднем для каждого Z-шаг и приобретение 21 последовательных 2,5 мкм Z-шаги для объема 200-225 50 мкм каждые 30 сек.
- После того как данные файлы хранятся на сервере лаборатории, Imaris или Volocity программное обеспечение может использоваться для выполнения многомерной визуализации и отслеживания ячейки 2, 3.
4. Представитель Результаты
1.Real времени (30f/sec) воображая нейтрофилов катилась судов в 200x. Временной интервал изображения показывает, нейтрофилы, в зеленом, катилась эндотелия кровеносных сосудов около 10 минут после заражения Listeria моноцитогенес, показаны красным цветом. Коллагеновых волокон в соединительной ткани, отображаются синим цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть видео.
2.Time покадровой 3D визуализации динамики нейтрофилов набора на 200x. Типичные нейтрофилов набора из обращения и миграции через воспаленные ткани показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео мы продемонстрируем протокол процедуры для неинвазивной визуализации 2P лейкоцитов вербовки в ответ на воспаление.
Пяте является классическим физиологических сайт для изучения воспаления, таких как аллергии, инфекции и аутоиммунные заболевания 4-7. 2P визуализации обеспечивает детальное представление о различных шагов в лейкоцитарной пути торговли людьми, из прокатных и адгезии в кровеносные сосуды хемотаксис на сайты эффекторные функции. Мы обнаружили, что лейкоцитов набор варьируется в ответ на различные типы воспалительных стимулов. Доза стимул должен быть выбраны тщательно и каждая попытка резюмировать физиологических оскорбление. Если доза слишком высокая или доставлены нефизиологических сайта, стимулом могла сокрушить хоста или привести к экспериментальные артефакты и производить аномальные явления. Мы рекомендуем титровать дозы стимулы для пилотных экспериментов в сочетании с подходящим управления и использования изогнутые иглы для повышения точности как объем доставлены и глубину инъекции. Очень важно также, что в месте инъекции может быть легко расположен, особенно для серийного экспериментов изображений. Это может быть достигнуто путем введения в определенном месте (например, вторая цифра на третьем пальце правой задней лапы) или татуировки на коже и инъекционных поблизости.
2P изображений предоставляет уникальную возможность для визуализации лейкоцитов торговли и эффекторные функции в живом организме. Большинство прижизненных изображений подходов, используемых для исследования лейкоцитов набора требуют хирургического вмешательства, чтобы подвергать ткани и кровеносные сосуды под наркозом 8-10 мышей. Сама операция вызывает воспаление, которое повлияет на поведение лейкоцитов. Тем не менее, 2P изображения позволяет лейкоцитов для изучения неинвазивно и в одноклеточных разрешение глубоко внутри родной среде 3D ткани. Кроме того, поскольку процесс создания образа сам по себе не вредит мышь, она является отличным выбором для проведения долгосрочных исследований на моделях рака и артрита. 2P изображений имеет потенциал, чтобы обеспечить и беспрецедентный ввиду болезненного процесса от начала заболевания и прогрессирование резолюции, все в пределах индивидуального субъекта животного. Такой подход является ценным инструментом для получения понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе клеточного иммунитета к инфекции и, как эти же ответы, если неправильно регулируется, может привести к воспалительным и аутоиммунных заболеваний. В конечном счете, детальную картину поведения лейкоцитов в естественных условиях будет помощь в разработке новых терапевтических средств для лечения воспалительных и инфекционных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами одобрено Комитетом исследования на животных из Вашингтонского университета в Сент-Луисе.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант R01-3155-53502 и Вашингтонского университета, Pfizer биомедицинских исследований Соглашения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A.
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C.
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
