Summary
Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.
Abstract
De dos fotones (2P), la microscopía es una técnica de imágenes de alta resolución que ha sido ampliamente adaptados por los biólogos. El valor de la microscopía de 2P es que proporciona una rica información espacio-temporal en relación con las conductas de células en los tejidos intactos y en ratones vivos. El reclutamiento de leucocitos juega un papel importante en la defensa del huésped contra la infección y cuando no se controla, puede contribuir a enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Estudiar el reclutamiento de leucocitos en vivo es técnicamente difícil ya que las células se mueven rápidamente dentro de los vasos situados en lo profundo de los tejidos dispersión de la luz. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios de imagen intravital requieren una preparación quirúrgica para exponer los vasos sanguíneos y los tejidos. Para evitar el daño a los tejidos y la inflamación inducida por la cirugía en sí, aquí, se describe una manera no invasiva de una sola célula enfoque de imágenes que se pueden utilizar para estudiar el tráfico de leucocitos en la almohadilla plantar del ratón y las falanges. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes 2P y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.
Protocol
1. Animal preparación:
Este protocolo utiliza un adulto hembra adulta eGFP LysM los ratones, en el que los neutrófilos y los macrófagos son marcados con fluorescencia mediante la expresión de eGFP 1.
- Etiquetado de los vasos sanguíneos:
Para visualizar los vasos sanguíneos, 15μl de la no-objetivo los puntos cuánticos (655nm) se diluyen en 100 l de PBS y se inyecta por vía intravenosa en el ratón 10-30 minutos antes de la imagen. - Anestesia:
- Coloque el ratón en la cámara de inducción del sistema de inhalación anestesia veterinaria (Noble Servicio Médico, Inc).
- Establecer el vaporizador a un 3-4% isoflurano y la compañía de oxígeno al 100% caudal de gas de aproximadamente 1 L / min. Para evitar una sobredosis accidental de anestesia, vigilar de cerca al animal hasta que el reflejo de los pies pizca trasera se ha perdido.
- La anestesia se mantuvo en el 1,5 ~ 2% de isoflurano y ajustado durante la exploración para minimizar los artefactos de respiración según sea necesario. La tasa de respiración del ratón se controla cuidadosamente a lo largo de la sesión de imágenes para asegurar un plano de anestesia adecuado.
- Ungüento Puralube veterinaria se aplica a los ojos para evitar la desecación.
- El ratón es colocado en un mercado regulado 36 ° C almohadilla eléctrica (Braintree Scientific) durante las inyecciones y las imágenes y para prevenir la hipotermia.
- Para prevenir la deshidratación, el mouse dispone de 100 l de PBS sc cada 1-2 horas.
- La entrega de un estímulo inflamatorio para inducir el reclutamiento de leucocitos:
- Coloque el ratón en la etapa de la cirugía y limpiar la almohadilla plantar con etanol al 70%.
- Doblar la aguja de una jeringa de insulina a 90 grados cerca del bisel para facilitar la inyección y mejorar la precisión de la profundidad de la entrega.
- Cargue la jeringa con 0,5 g de E. coli biopartículas diluido en PBS 1μl. Esto se puede hacer en la tapa de un tubo de microcentrífuga para que sea más fácil de cargar la gota.
- Mantener el dedo con una pinza curva e introduzca la aguja con cuidado a través de la piel con el bisel hacia arriba hasta que esté justo por debajo de la piel.
- Inyectar lentamente y mantenerlos en su lugar por 5 segundos para evitar que cualquier nuevo color.
2. Imágenes de instalación etapa:
La plataforma de imagen consiste en una placa de aluminio con un orificio circular hecho en el centro. Una cubierta de cristal grande se pega a la parte inferior de la placa y un anillo de goma se pega en la parte superior para crear una cámara de empotrar estanca a los fluidos para dar cabida a la pata trasera. La placa de aluminio se calienta a 36 ° C a través de dos elementos de calefacción conectado a la parte superior de la placa.
- Coloque el ratón en el escenario de imágenes pre-calentado y mantener la temperatura corporal central del ratón usando el teclado 36 ° C de calentamiento.
- Asegure la pata para el cubre objetos de la cámara de imágenes con una fina capa de pegamento.
- Lavar la pata dos veces para eliminar cualquier resto flotante de la cola y luego llenar la cámara con PBS (pre-calentado a 36 ° C).
Los ratones se pueden obtener imágenes de hasta 4 horas sin comprometer la viabilidad del animal. El pie puede ser lanzado suavemente con una pequeña cantidad de acetona y ratones revivido para los estudios de imagen longitudinal. Sin embargo, en este caso, se recomienda el período de imagen para <2 horas y esperar 24-48 horas entre las sesiones para reducir al mínimo el riesgo de sobredosis de anestesia o deshidratación.
3. La adquisición de imágenes
El microscopio de dos fotones (microscopio 2P) utilizado en este protocolo es una costumbre-construido de doble láser de vídeo de tipo sistema que consiste en un microscopio vertical. El sistema está equipado con dos Ti: Zafiro láser, cuatro de frente Bi-álcali PMT para la adquisición simultánea de los canales 3 y 4 y un objetivo de 20x de inmersión de agua (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Sintonice el Camaleón XR Ti: zafiro láser (coherente Inc.) a 890-900nm.
- Utilice espejos dicroicos 480nm y 560 nm (SemRoc) para separar los tres canales: rojo (<480 nm, la señal de la segunda generación armónica), verde (480-560nm, LysM-eGFP neutrófilos positivos) y rojo (> 560 nm, puntos cuánticos marcado los vasos sanguíneos ). Por otra parte, el filtro de 560 nm puede ser reemplazado con un filtro de 570 nm para distinguir E. biopartículas coli (576nm biopartículas aparecerá de color naranja) de 655nm puntos cuánticos (aparece de color rojo oscuro).
- Baje cuidadosamente el objetivo en el PBS y se centran en un buque de la puntera.
- Con la operación de imagen de vídeo a la velocidad de adquisición de cambio (30f/sec) y el uso de la señal de segundo armónico que emana de colágeno como un hito del tejido, de forma rápida encuesta del tejido (a una velocidad de adquisición de vídeo de baja calidad) para localizar un vaso sanguíneo de interés (un con visible eGFP lysM los neutrófilos).
- Ajustar la ganancia de la PMT para optimizar la separación de colores y reducir al mínimo la cantidad de láser necesarios para lograr suficiente señal más de fondo (secuidado de no saturar la imagen!).
- Una vez que la región de los intereses de la zona se encuentra, comienza el tiempo de imágenes a intervalos. Time-lapse de imágenes se puede realizar con dos resoluciones temporales diferentes. Para el despliegue de imágenes de células y la adhesión y en tiempo real dentro de los vasos sanguíneos, que adquirimos 30f/sec en un solo plano-z. Para la documentación de la extravasación y la migración celular en el parénquima que realizamos en 3D de imágenes a intervalos de tiempo. Un protocolo de adquisición general están integradas por un promedio de 15 cuadros por cada Z a paso y la adquisición de 21 2.5μm secuencial z-pasos para un volumen de 200-225 50 micras en intervalos de 30 segundos.
- Una vez que los archivos de datos se almacenan en el servidor del laboratorio, software o Imaris Volocity se puede utilizar para llevar a cabo la representación multi-dimensional y la célula de seguimiento de 2, 3.
4. Resultados representante
1.Real tiempo (30f/sec) imaginación de los neutrófilos rodando a lo largo de los vasos en 200x. Lapso de tiempo de imágenes muestra los neutrófilos, en verde, rodando por el endotelio de los vasos sanguíneos a unos 10 minutos después de la infección con Listeria monocytogenes, que se muestra en rojo. Las fibras de colágeno en el tejido conectivo aparecen en azul. Por favor, haga clic aquí para ver el video.
2.Time-lapse de imágenes en 3D de la dinámica de reclutamiento de neutrófilos en 200x. Reclutamiento de neutrófilos típicos de la circulación y la migración a través del tejido inflamado se muestra. Por favor, haga clic aquí para ver el video.
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Discussion
En este protocolo de vídeo que muestran los procedimientos para obtener imágenes de 2P no invasiva de reclutamiento de leucocitos en respuesta a la inflamación.
La pata es un sitio clásico fisiológicas para el estudio de la inflamación, tales como la enfermedad de la alergia, infección y enfermedades autoinmunes 4-7. 2P imagen proporciona una imagen detallada de los distintos pasos en las vías de tráfico de leucocitos, de rodamiento y adhesión en los vasos sanguíneos de la quimiotaxis de los sitios de la función efectora. Hemos encontrado que el reclutamiento de leucocitos varía en respuesta a diferentes tipos de estímulos inflamatorios. La dosis del estímulo deben ser elegidos cuidadosamente y todo intento de recapitular un insulto fisiológico. Si la dosis es demasiado alta o entregados a un sitio no fisiológico, el estímulo podría sobrepasar el anfitrión o dar lugar a artefactos experimentales y producir fenómenos anormales. Se recomienda dosis correspondientes de estímulos para las experiencias piloto se combina con un adecuado control y el uso de una aguja doblada para aumentar la precisión de los dos el volumen entregado y la profundidad de la inyección. También es fundamental que el sitio de la inyección puede ser localizado fácilmente, especialmente para los experimentos de imagen de serie. Esto se puede lograr mediante la inyección en un lugar específico (es decir, el segundo dígito en tercer dedo de la pata trasera derecha) o por el tatuaje de la piel y la inyección de cerca.
2P de imagen ofrece una oportunidad única para visualizar el tráfico de leucocitos y la función efectora in vivo. La mayoría de las imágenes intravital métodos utilizados para estudiar el reclutamiento de leucocitos requieren cirugía para exponer los tejidos y los vasos sanguíneos en ratones anestesiados 80-10. La cirugía en sí induce la inflamación que afectarán el comportamiento de los leucocitos. Sin embargo, 2P imágenes permite leucocitos a estudiar de forma no invasiva y en una sola célula de resolución de profundidad en el entorno de los tejidos en 3D nativa. Además, dado que el procedimiento de imagen en sí no es perjudicial para el ratón, que es una excelente opción para llevar a cabo estudios longitudinales para los modelos de cáncer y la artritis. 2P imágenes tiene el potencial para proporcionar y visión sin precedentes de un proceso de la enfermedad desde el inicio y la progresión de la enfermedad de la resolución, todo ello en un sujeto animal. Este enfoque es una herramienta valiosa para la obtención de información sobre los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la inmunidad celular a la infección y cómo estas mismas respuestas, si no se regula, puede dar lugar a enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En última instancia, una imagen detallada del comportamiento de los leucocitos en vivo será de ayuda en el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades inflamatorias e infecciosas.
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Disclosures
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Estudios de Animales de la Universidad de Washington en St Louis.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01-3155-53502 y la Universidad de Washington-Pfizer Acuerdo de Investigación Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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