Summary
Här beskriver vi en icke-invasiv två-photon (2P) mikroskopi metod för att studera leukocyt homing på mus footpad. Vi diskuterar de tekniska aspekterna av våra vävnader bildhantering förberedelse och gå läsaren genom ett typiskt experiment från första inrättades för att genomförande och datainsamling.
Abstract
Två-foton (2P) mikroskopi är en högupplöst bildteknik som har i stort sett anpassats av biologer. Värdet av 2P mikroskopi är att det ger rika Spatiotemporal information om cellens beteende inom intakta vävnader och i levande möss. Leukocyte rekrytering spelar en betydande roll i infektionsförsvaret och när okontrollerat, kan bidra till inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar. Studera leukocyt rekrytering in vivo är tekniskt utmanande eftersom celler går snabbt inom fartyg ligger djupt inom ljusspridning vävnader. Hittills har de flesta intravital imaging studier kräver kirurgisk förberedelse att avslöja blodkärl och vävnader. För att undvika vävnadsskador och inflammation orsakad av kirurgi själv, här beskriver vi en icke-invasiv encelliga avbildningsteknik som kan användas för att studera leukocyt handel med musen footpad och falanger. Vi diskuterar de tekniska aspekterna av vår 2P bildhantering förberedelse och gå läsaren genom ett typiskt experiment från första inrättades för att genomförande och datainsamling.
Protocol
1. Animal förberedelser:
Detta protokoll använder vuxna kvinnliga vuxna LysM-EGFP möss, där neutrofiler och makrofager fluorescerande märks genom de EGFP 1.
- Märkning blodkärl:
Att visualisera blodkärl, 15μl av icke-riktade kvantprickar (655nm) späds i 100 l av PBS och injiceras intravenöst i musen 10-30 min före avbildning. - Anestesi:
- Placera musen i induktionskammare av det veterinärmedicinska inhalationsanestesi systemet (Noble Medicinsk Service, Inc).
- Ställ förångaren till 3-4% isofluran och 100% syrgas bärgas flöde till ~ 1 l / min. För att förhindra oavsiktlig anestesi överdos, noga övervaka djuret tills den bakre tå nypa reflex försvinner.
- Anestesi hålls på 1,5 ~ 2% isofluran och finjusteras under avbildning för att minimera andning artefakter som behövs. Andning av musen övervakas noggrant under hela avbildning session för att försäkra en adekvat plan av anestesi.
- Puralube veterinära salva appliceras på ögonen för att förhindra uttorkning.
- Musen placeras på en reglerad 36 ° C värmedyna (Braintree vetenskapliga) under injektioner och avbildning och för att förebygga hypotermi.
- För att förhindra uttorkning, är musen ges 100 l PBS fm var 1-2 timmar.
- Leverera en inflammatorisk stimulans för att förmå leukocyt rekrytering:
- Placera musen på operation scenen och torka av footpad med 70% etanol.
- Böj nålen på en spruta ~ 90 grader nära avfasning för att underlätta injektionen och förbättra precisionen i leveransen djup.
- Ladda spruta med 0,5 mikrogram av E.coli bioparticles utspätt i 1μl PBS. Detta kan göras i locket på en mikrofugrör att göra det lättare att lasta droppen.
- Håll tå med böjda pincett och stick in nålen försiktigt genom huden med avfasningen uppåt tills den är precis under huden.
- Injicera långsamt och håll på plats i 5 sekunder för att förhindra tillbaka flush.
2. Imaging steg installation:
Den avbildning plattformen består av en aluminiumplatta med ett cirkulärt hål skär genom centrum. En stor skyddsglas limmas i botten av tallriken och en O-ring är limmad på toppen för att skapa en fluid-tight infällda kammare för att rymma den bakre tass. Plåten värms till 36 ° C med hjälp av två värmeelement knutna till toppen av plattan.
- Placera musen på förvärmda avbildning scenen och hålla musens kroppstemperaturen med 36 ° C uppvärmning pad.
- Säkra tass till coverglass av avbildning kammare med en tunn film av superlim.
- Tvätta tass två gånger för att avlägsna flytande bitar av lim och sedan fylla kammaren med färska PBS (förvärmas till 36 ° C).
Möss kan avbildas i upp till 4 timmar utan att kompromissa djurets livskraft. Foten kan lätt frigöras med mindre mängd aceton och möss återupplivades för longitudinella imaging studier. Men i detta fall rekommenderar vi avbildning perioden till <2 timmar och väntar 24-48 timmar mellan passen för att minimera risken för anestesi överdosering eller uttorkning.
3. Imaging Acquisition
De två-photon mikroskop (2P mikroskop) som används i detta protokoll är en specialbyggd dubbla laser video-rate system bestående upprätt mikroskop. Systemet är utrustat med två Ti: Sapphire lasrar, fyra huvud-på Bi-alkali PMTs för samtidig 3 och 4 kanals förvärv och en 20x nedsänkning i vatten mål (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Trimma Chameleon XR Ti: safir laser (Coherent Inc.) till 890-900nm.
- Använd 480nm och 560nm dikroiskt speglar (SemRoc) för att avgränsa tre kanaler: blå (<480 nm, andra harmonic generation signal), grönt (480-560nm, LysM-EGFP positiva neutrofiler) och röd (> 560 nm, quantum dot märkta blodkärl ). Alternativt kan 560nm filter ersättas med en 570nm filter för att skilja E. coli bioparticles (576nm bioparticles visas orange) från 655nm kvantprickar (visas djupröd).
- Sänk försiktigt ned målet i PBS och fokusera på ett fartyg av tån.
- Med bilden förvärvet hastighet som arbetar vid video-rate (30f/sec) och använda den andra övertonen signalen från kollagen som vävnads landmärke, snabbt kartlägga vävnaden (på video-rate förvärvet hastighet) för att hitta ett blodkärl av intresse (ett med synliga lysM-EGFP neutrofiler).
- Ställ in GAIN på PMTs att optimera färg separation och minimera mängden av laser för att uppnå tillräcklig signal över bakgrunden (varanoga med att inte mätta bilden!).
- När området regionen intressen ligger, börjar tidsförlopp avbildning. Time-lapse avbildning kan utföras med två olika temporal upplösning. För avbildning cell rullning och vidhäftning och i realtid i blodkärlen, förvärvar vi 30f/sec vid en enda z-plan. För att dokumentera cell extravasering och migration i parenkymet vi utför 3D time-lapse avbildning. En typisk förvärvet protokoll kommer att bestå av i genomsnitt 15 bildrutor för varje Z-steg och förvärvar 21 sekventiell 2.5μm z-steg för en volym på 200-225 50μm vid 30 sek mellanrum.
- När data lagras på labbet servern kan Imaris eller Volocity mjukvara användas för att utföra flerdimensionella rendering och cell tracking 2, 3.
4. Representativa resultat
1.Real-tid (30f/sec) föreställa av neutrofila rullande längs fartyg till 200x. Time lapse avbildning visar neutrofiler, i grönt, rullande längs endotelet i blodkärlen ca 10mins efter infektion med Listeria monocytogenes, visas i rött. Kollagenfibrer i bindväven visas i blått. Klicka här för att se videon.
2.Time-lapse 3D-avbildning av neutrofila rekrytering dynamik på 200x. Typiska neutrofila rekryteringen från cirkulationen och migration genom inflammerad vävnad visas. Klicka här för att se videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här videon protokoll visar vi de förfaranden för icke-invasiv 2P avbildning av leukocyt rekrytering som svar på inflammation.
Den footpad är en klassisk fysiologisk plats för att studera inflammation som allergi, infektion och autoimmun sjukdom 4-7. 2P bildbehandling ger en detaljerad bild av olika steg i leukocyt människohandel vägar, rullar och fäste för blodkärlen att chemotaxis till webbplatser av effektor funktion. Vi har funnit att den leukocyter rekryteringen varierar till följd av olika typer av inflammatoriska stimuli. Dosen av den stimulans bör väljas noggrant och varje försök gjorts för att rekapitulera en fysiologisk förolämpning. Om dosen är för hög eller levereras till en icke-fysiologiska plats, kan stimulans överväldiga värden eller leda till experimentella artefakter och producera onormala fenomen. Vi rekommenderar titrerade doser av stimuli för pilotförsök ihopkopplad med en lämplig kontroll och med hjälp av en böjd nål för att öka precisionen i både levererade volymen och djupet av injektionen. Det är också viktigt att injektionsstället lätt kan lokaliseras, särskilt för seriell avbildning experiment. Detta kan göras genom att injicera på en viss plats (dvs. andra siffran på tredje tån på höger bakben tass) eller tatuering huden och injicera i närheten.
2P bildbehandling ger en unik möjlighet att visualisera leukocyt människohandel och effektor funktion in vivo. Majoriteten av intravital avbildning metoder som används för att studera leukocyt rekrytering kräver operation för att exponera vävnad och blodkärl i sövda möss 8-10. Operationen i sig inducerar inflammation som kommer att påverka leukocyt beteende. Men låter 2P avbildning leukocyter studeras icke-invasivt och i encelliga upplösning djupt inom den infödda 3D vävnaden miljö. Eftersom det avbildning själva förfarandet inte skadar musen, det är ett utmärkt val för att genomföra longitudinella studier för modeller av cancer och artrit. 2P avbildning har potential att tillhandahålla och helt ny bild av en sjukdomsprocess från sjukdom initiering och progression till upplösning, allt i ett enskilt djur ämne. Detta synsätt är ett värdefullt verktyg för att få insikt i cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom cellulär immunitet mot infektioner och hur dessa samma svar, om felaktigt reglerat, kan leda till inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar. I slutändan kommer en detaljerad bild av leukocyt uppträdande in vivo vara stöd i utvecklingen av nya läkemedel för behandling av inflammatoriska och infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla experiment utfördes enligt protokoll godkänts av Animal Studies kommitté Washington University i St Louis.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bevilja R01-3155 till 53.502 och Washington University, Pfizer biomedicinsk forskning avtal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A. Allergy in experimental mouse tuberculosis. Am Rev Tuberc. 72, 171-195 (1955).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13313-13318 (1998).
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
