Summary
Aqui, descrevemos um método não invasivo de dois fótons abordagem microscopia (2P) para estudo de leucócitos homing na pata do rato. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação tissular e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.
Abstract
Dois fótons de microscopia (2P) é uma técnica de imagem de alta resolução que tem sido amplamente adaptado por biólogos. O valor da microscopia 2P é que ela fornece informações sobre comportamentos espaço-temporal rica de células dentro dos tecidos intactos e em camundongos vivos. O recrutamento de leucócitos desempenha um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção e, quando for devidamente controlado, pode contribuir para doenças inflamatórias e autoimunes. Estudar o recrutamento de leucócitos in vivo é tecnicamente desafiador vez que as células estão se movendo rapidamente dentro dos vasos localizados no interior dos tecidos de espalhamento de luz. Até o momento, estudos de imagem mais intravital requerem uma preparação cirúrgica para expor os vasos sanguíneos e tecidos. Para evitar o dano tecidual e inflamação induzida por cirurgia em si, aqui, descrevemos uma abordagem não-invasiva por imagem de uma única célula que pode ser usado para estudar o tráfico de leucócitos na pata de rato e falanges. Discutimos os aspectos técnicos de nossa preparação imagem 2P e andar o leitor através de um experimento típico de configuração inicial para coleta de execução e de dados.
Protocol
1. Preparação dos animais:
Este protocolo usa adulto fêmea adulta LysM eGFP-ratos, nos quais os neutrófilos e os macrófagos são fluorescente etiquetado pela expressão de eGFP 1.
- Rotulagem dos vasos sanguíneos:
Para visualizar os vasos sanguíneos, 15μl de pontos não-alvo quantum (655nm) são diluídos em 100 ul de PBS e injetada por via intravenosa no min do mouse antes de 30/10 de imagem. - Anestesia:
- Posicione o mouse na câmara de indução do sistema veterinário anestesia por inalação (Noble Medical Service, Inc).
- Definir o vaporizador a 3-4% do isoflurano e os 100% de oxigênio caudal do gás para ~ 1 L / min. Para evitar overdose acidental anestesia, acompanhar de perto o animal até que o reflexo pitada traseira toe está perdido.
- A anestesia é mantida em 1,5 ~ 2% do isoflurano e afinado durante o exame para minimizar os artefatos de respiração quando necessário. A taxa de respiração do mouse é cuidadosamente monitorizados durante toda a sessão de imagens para garantir um plano adequado de anestesia.
- Puralube pomada veterinária é aplicada para os olhos para evitar a secagem.
- O mouse é colocado sobre uma regulada 36 ° C de aquecimento pad (Braintree Científica) durante as injeções e imagem e para evitar a hipotermia.
- Para evitar a desidratação, o mouse é dado 100 ul de PBS sc a cada 1-2 horas.
- Entrega de um estímulo inflamatório para induzir o recrutamento de leucócitos:
- Posicione o mouse no palco cirurgia e swab da pata com etanol 70%.
- Dobrar a agulha de uma seringa de insulina ~ 90 graus próximo ao bisel para facilitar a injeção e melhorar a precisão da profundidade de entrega.
- Carregar a seringa com 0,5 mg de E.coli bioparticles diluído em PBS 1μl. Isto pode ser feito na tampa de um tubo de microcentrífuga para torná-lo mais fácil de carregar a gota.
- Segure o dedo do pé com uma pinça curva e inserir a agulha delicadamente através da pele com o bisel voltado para cima até que esteja logo abaixo da pele.
- Injetar lentamente e mantenha no lugar por 5 segundos para evitar qualquer volta flush.
2. Imagem de instalação palco:
A plataforma de imagem consiste em uma placa de alumínio com um furo circular cortam o centro. A tampa de vidro grande é colado ao fundo do prato e uma borracha O-ring está colado na parte superior para criar uma câmara de líquido apertado recesso para acomodar a pata traseira. A placa de alumínio é aquecido a 36 ° C através de dois elementos de aquecimento ligado ao topo da placa.
- Posicione o mouse sobre o estágio de imagem pré-aquecido e manter a temperatura corporal central do mouse usando o teclado de 36 ° C de aquecimento.
- Segura a pata para a lamela da câmara de imagem com uma fina camada de supercola.
- Lavar a pata duas vezes para remover todos os bocados flutuante de cola e, em seguida, preencher a câmara com PBS fresco (pré-aquecido a 36 ° C).
Ratos podem ser visualizados por até 4 horas sem comprometer a viabilidade do animal. O pé pode ser gentilmente lançado com pequena quantidade de acetona e camundongos revived para estudos de imagem longitudinal. No entanto, neste caso, recomendamos o período de imagem para <2 horas e de espera entre as sessões de 24-48 h para minimizar o risco de overdose de anestesia ou desidratação.
3. Imaging Acquisition
O microscópio de dois fotões (microscópio 2P) utilizado neste protocolo é uma custom-built duplo-laser sistema de vídeo-taxa composta de um microscópio de pé. O sistema é equipado com dois Ti: Sapphire lasers, quatro de frente Bi-alcalinos PMTs para aquisições simultâneas 3 e 4 canais e um 20x objetivo imersão em água (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Ajustar o Chameleon XR Ti: safira laser (Coherent, Inc.) para 890-900nm.
- Use 480nm e 560nm espelhos dicróicos (SemRoc) para separar três canais: azul (<480 nm, sinal de geração de segundo harmônico), verde (480-560nm, LysM-eGFP neutrófilos positivo) e vermelho (> 560 nm, quantum dot vasos sanguíneos rotulados ). Alternativamente, o filtro de 560nm pode ser substituído por um filtro de 570nm de distinguir E. bioparticles coli (576nm bioparticles aparecerá laranja) de 655nm pontos quânticos (aparecerá vermelho escuro).
- Cuidadosamente abaixe o objetivo para o PBS e se concentrar em um navio do dedo do pé.
- Com a velocidade de operação de aquisição de imagem em vídeo-rate (30f/sec) e usando o sinal de segunda harmónica que emana de colágeno como um marco de tecido, de forma rápida pesquisa do tecido (no vídeo da taxa de velocidade de aquisição) para localizar um vaso sanguíneo de interesse (uma com visível lysM eGFP-neutrófilos).
- Ajustar o ganho no PMTs para otimizar a separação de cores e minimizar a quantidade de laser necessária para conseguir sinal suficiente sobre o fundo (sercuidado para não saturar a imagem!).
- Uma vez que região de superfície de interesses está localizado, comece lapso de tempo de imagem. Lapso de tempo de imagens pode ser realizada com dois diferentes resoluções temporal. Para rolar imagens de células e aderência e em tempo real dentro dos vasos sanguíneos, adquirimos 30f/sec em um único plano-z. Para documentar o extravasamento e migração celular no parênquima realizamos imagem lapso de tempo 3D. Um protocolo de aquisição típico será composto de uma média de 15 frames para cada Z-passo e adquirir 21 2.5μm seqüencial z-passos para um volume de 200-225 50 ìm em intervalos de 30 seg.
- Uma vez que os arquivos de dados são armazenados no servidor do laboratório, software ou Imaris Volocity pode ser usado para executar multi-dimensional de renderização e rastreamento de células 2, 3.
4. Resultados representante
1.Real-time (30f/sec) imaginação de neutrófilos rolando ao longo dos vasos em 200x. Lapso de tempo imagem mostra neutrófilos, em verde, rolando ao longo do endotélio dos vasos sanguíneos sobre 10mins após a infecção com Listeria monocytogenes, mostrado em vermelho. Fibras de colágeno no tecido conjuntivo aparecem em azul. Clique aqui para ver o vídeo.
2.Time-lapso de imagem 3D de dinâmica de recrutamento de neutrófilos em 200x. Recrutamento de neutrófilos típico de circulação e migração através do tecido inflamado é mostrado. Clique aqui para ver o vídeo.
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Discussion
Neste protocolo de vídeo demonstramos os procedimentos para não-invasivos de imagem 2P de recrutamento de leucócitos em resposta à inflamação.
A pata é um site clássico fisiológicos para o estudo de inflamação, tais como infecções, alergias e doença auto-imune 4-7. 2P imagem fornece um quadro detalhado de etapas distintas, em vias de tráfico de leucócitos, de rolamento e adesão nos vasos sanguíneos de quimiotaxia para sites de função efetora. Nós descobrimos que o recrutamento de leucócitos varia em resposta a diferentes tipos de estímulos inflamatórios. A dose de estímulo devem ser cuidadosamente escolhidas e cada tentativa de recapitular um insulto fisiológico. Se a dose for muito alta ou entregue a um site não-fisiológicos, o estímulo pode sobrecarregar o host ou levar a artefatos experimentais e produzir fenômenos anormais. Recomendamos titulação das doses de estímulos para experiências piloto emparelhado com um controle adequado e usando uma agulha torta para aumentar a precisão de tanto o volume entregue e da profundidade da injeção. É também crucial que o local da injeção podem ser facilmente localizados, especialmente para experimentos de imagens em série. Isso pode ser feito através da injeção em um local específico (isto é, segundo dígito no terceiro dedo da pata posterior direita) ou por tatuagem na pele e injetando nas proximidades.
2P imagem proporciona uma oportunidade única para visualizar o tráfico de leucócitos e função efetora in vivo. A maioria das imagens intravital abordagens utilizadas para estudar o recrutamento de leucócitos requerem cirurgia para expor os tecidos e vasos sanguíneos em ratos anestesiados 80-10. A cirurgia em si induz a inflamação que terá impacto sobre o comportamento de leucócitos. No entanto, 2P imagem permite leucócitos a ser estudado de forma não invasiva e em uma única célula de resolução de profundidade dentro do ambiente 3D do tecido nativo. Além disso, uma vez que o procedimento de imagem em si não prejudica o mouse, ele é uma excelente escolha para a realização de estudos longitudinais para os modelos de câncer e artrite. 2P imagem tem o potencial de fornecer e visão sem precedentes de um processo de doença desde o início da doença e progressão para a resolução, todos dentro de um assunto animal individual. Esta abordagem é uma ferramenta valiosa para a obtenção de esclarecimentos sobre os mecanismos celulares e moleculares que estão na base da imunidade celular à infecção e como essas mesmas respostas, se inadequadamente regulado, pode levar a doenças inflamatórias e autoimunes. Enfim, um quadro detalhado do comportamento de leucócitos in vivo será ajudar no desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento de doenças inflamatórias e infecciosas.
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Disclosures
Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Estudos de Animais da Universidade de Washington em St Louis.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01-3155-53.502 e da Universidade de Washington Acordo-Pfizer de Investigação Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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