Summary
Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.
Abstract
A due fotoni (2P) microscopia è una tecnica di imaging ad alta risoluzione che è stata ampiamente adattato dai biologi. Il valore di microscopia 2P è che fornisce ricche informazioni spazio-temporali per quanto riguarda i comportamenti delle cellule all'interno dei tessuti intatti e in topi vivi. Reclutamento dei leucociti svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro le infezioni e quando incontrollato, può contribuire a malattie infiammatorie e autoimmuni. Studiare il reclutamento dei leucociti in vivo è tecnicamente impegnativo poiché le cellule si spostano rapidamente all'interno dei vasi situato in profondità all'interno dei tessuti dispersione della luce. Fino ad oggi, gli studi di imaging più intravitale richiedono una preparazione chirurgica per esporre i vasi sanguigni e dei tessuti. Per evitare il danno ai tessuti e l'infiammazione indotta da un intervento chirurgico se stessa, qui, si descrive un non-invasiva a cella singola approccio di imaging che può essere utilizzato per studiare il traffico dei leucociti nella zampa del mouse e falangi. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione 2P imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.
Protocol
1. Animal preparazione:
Questo protocollo utilizza adulto femmina adulta LysM-eGFP topi, nei quali neutrofili e macrofagi sono fluorescente mediante l'espressione di eGFP 1.
- L'etichettatura dei vasi sanguigni:
Per visualizzare i vasi sanguigni, 15μl di non mirato quantum dots (655nm) sono diluiti in 100 ml di PBS e iniettato per via endovenosa nel topo 10-30 minuti prima di imaging. - Anestesia:
- Posizionare il mouse nella camera di induzione del sistema veterinario anestesia per inalazione (Nobile Medical Service, Inc).
- Impostare il vaporizzatore al 3-4% isoflurano e il 100% vettore ossigeno portata gas a ~ 1 L / min. Per evitare il sovradosaggio di anestesia, monitorare attentamente l'animale fino alla parte posteriore reflex pizzico punta è perso.
- L'anestesia è mantenuta a 1,5 ~ 2% isoflurano e perfezionato durante l'imaging per minimizzare gli artefatti di respirazione, se necessario. Il tasso di respirazione del mouse viene monitorata con attenzione per tutta la sessione di imaging per assicurare un adeguato piano di anestesia.
- Unguento Puralube veterinario viene applicato agli occhi per evitare l'essiccazione.
- Il mouse è posizionato su un mercato regolamentato 36 ° C il riscaldamento pad (Braintree scientifico) durante le iniezioni e di imaging e per prevenire l'ipotermia.
- Per prevenire la disidratazione, il mouse viene dato 100 l di PBS sc ogni 1-2 ore.
- Fornire uno stimolo infiammatorio per indurre il reclutamento dei leucociti:
- Posizionare il mouse sul palco chirurgia e tampone la zampa con il 70% di etanolo.
- Piegare l'ago di una siringa per insulina ~ 90 gradi vicino alla coppia conica per facilitare l'iniezione e migliorare la precisione della profondità di consegna.
- Caricare la siringa con 0,5 mg di E.coli bioparticles diluito in 1ml PBS. Questo può essere fatto nel coperchio di una provetta per microcentrifuga per rendere più facile caricare la goccia.
- Tenere la punta con una pinza curva e inserire l'ago con delicatezza attraverso la pelle con lo smusso rivolto verso l'alto fino a quando è appena sotto la pelle.
- Iniettare lentamente e tenere in posizione per 5 secondi per evitare qualsiasi nuovo colore.
2. Imaging fase di impostazione:
La piattaforma di imaging è costituito da una piastra di alluminio con un foro circolare tagliato attraverso il centro. Una grande copertura in vetro è incollato al fondo del piatto e una gomma O-ring è incollata sulla parte superiore per creare un fluido a tenuta di camera da incasso per ospitare la zampa posteriore. La piastra di alluminio viene riscaldato a 36 ° C tramite due resistenze fissato alla parte superiore della piastra.
- Posizionare il mouse sul pre-riscaldato fase di imaging e di mantenere il mouse temperatura corporea utilizzando il pad ° 36 C di riscaldamento.
- Fissare la zampa al coprioggetti della camera di immagini con un sottile strato di colla.
- Lavare la zampa due volte per rimuovere qualsiasi bit floating di colla e poi riempire la camera con PBS fresco (pre-riscaldato a 36 ° C).
I topi possono essere esposte per un massimo di 4 ore senza compromettere la vitalità dell'animale. Il piede può essere gentilmente rilasciato con piccola quantità di acetone e topi rivivere per gli studi di imaging longitudinali. Tuttavia, in questo caso, si consiglia il periodo di imaging per <2 ore e 24-48 ore di attesa tra una sessione di ridurre al minimo il rischio di overdose anestesia o disidratazione.
3. Imaging Acquisition
Il microscopio a due fotoni (microscopio 2P) utilizzata in questo protocollo è una custom-built dual-laser di video-tasso di sistema composto da un microscopio verticale. Il sistema è dotato di due Ti: Sapphire laser, quattro a testa alta Bi-soda PMT per il controllo simultaneo acquisizioni canale 3 e 4, e un obiettivo 20x immersione in acqua (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Tune il Camaleonte XR laser Ti: zaffiro (Coherent Inc.) a 890-900nm.
- Utilizzare specchi dicroici 480nm e 560nm (SemRoc) per separare tre canali: blu (<480 nm, la seconda generazione del segnale armonica), verde (480-560nm, LysM-eGFP neutrofili positivi) e rosso (> 560 nm, quantum dot vasi sanguigni etichettati ). In alternativa, il filtro 560nm può essere sostituito con un filtro a 570nm per distinguere E. bioparticles coli (576nm bioparticles apparirà arancione) da 655nm quantum dots (apparirà di colore rosso intenso).
- Abbassare con cautela l'obiettivo in PBS e concentrarsi su una nave della punta.
- Con il sistema operativo velocità di acquisizione dell'immagine a video-rate (30f/sec) e utilizzando il segnale di seconda armonica proveniente da collagene come punto di riferimento dei tessuti, in modo rapido sondaggio del tessuto (in video-tasso di velocità di acquisizione) per individuare un vaso di sangue di interesse (uno con visibile lysM-eGFP neutrofili).
- Regolare il guadagno del PMT per ottimizzare la separazione dei colori e minimizzare la quantità di laser necessario a conseguire segnale sufficiente su sfondo (daattenzione a non saturare l'immagine!).
- Una volta regione area di interesse si trova, iniziare time-lapse imaging. Time-lapse imaging possono essere eseguiti con due diverse risoluzioni temporali. Per la laminazione di imaging cellulare e di adesione e in tempo reale all'interno dei vasi sanguigni, acquistiamo 30f/sec ad un unico piano z. Per documentare lo stravaso delle cellule e la migrazione nel parenchima eseguiamo 3D time-lapse imaging. Un protocollo di acquisizione tipico sarà composta da una media di 15 fotogrammi per ogni Z-passo e l'acquisizione di 21 2.5μm sequenziale z-passi per un volume di 200-225 50 micron ad intervalli di 30 sec.
- Una volta che i file di dati vengono memorizzati sul server di laboratorio, software Imaris o Volocity può essere utilizzato per eseguire il rendering multi-dimensionale e il monitoraggio delle cellule 2, 3.
4. Rappresentante Risultati
1.Real-time (30f/sec) immaginando di neutrofili laminazione lungo i vasi a 200x. Passa il tempo di imaging mostra neutrofili, in verde, rotolando lungo l'endotelio dei vasi sanguigni circa 10 minuti dopo l'infezione con Listeria monocytogenes, in rosso. Le fibre di collagene nel tessuto connettivo appaiono in blu. Clicca qui per vedere il video.
2.I-lapse imaging 3D delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili a 200x. Tipiche di reclutamento dei neutrofili dalla circolazione e migrazione attraverso il tessuto infiammato viene mostrato. Clicca qui per vedere il video.
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Discussion
In questo protocollo video dimostriamo le modalità di imaging non invasiva 2P di reclutamento dei leucociti in risposta all'infiammazione.
La zampa è un sito classico fisiologici per lo studio dell'infiammazione come la malattia di allergie, infezioni e autoimmuni 4-7. 2P di imaging fornisce un quadro dettagliato delle fasi distinte nei percorsi traffico dei leucociti, dal rotolamento e adesione nei vasi sanguigni di chemiotassi ai siti delle funzioni effettrici. Abbiamo scoperto che il reclutamento dei leucociti varia in risposta a diversi tipi di stimoli infiammatori. La dose dello stimolo deve essere scelto con cura ed ogni tentativo di ricapitolare un insulto fisiologico. Se la dose è troppo alta o consegnato a un non-fisiologico sito, lo stimolo potrebbe sopraffare l'host o portare ad artefatti sperimentali e produrre fenomeni anomali. Si consiglia di dosi titolate di stimoli per gli esperimenti pilota in coppia con un controllo adeguato e con un ago piegato per aumentare la precisione sia del volume erogato e la profondità di iniezione. E 'anche fondamentale che il sito di iniezione può essere facilmente identificabile, in particolare per gli esperimenti di imaging di serie. Questo può essere ottenuto iniettando in una posizione specifica (cioè, secondo cifre sul terzo dito della zampa posteriore destra), o con un tatuaggio sulla pelle e iniettare nelle vicinanze.
2P di imaging offre un'opportunità unica di visualizzare il traffico dei leucociti e la funzione effettrice in vivo. La maggior parte delle immagini intravitale approcci utilizzati per studiare il reclutamento dei leucociti richiedere un intervento chirurgico per esporre i tessuti e vasi sanguigni in topi anestetizzati 8-10. La stessa chirurgia induce l'infiammazione che avrà un impatto comportamento dei leucociti. Tuttavia, 2P di imaging permette leucociti da studiare in modo non invasivo e in cella singola risoluzione in profondità all'interno dell'ambiente nativo tessuto 3D. Inoltre, poiché la procedura di imaging in sé non danneggia il mouse, è una scelta eccellente per l'esecuzione di studi longitudinali per i modelli di cancro e l'artrite. 2P di imaging ha il potenziale per fornire e visione senza precedenti di un processo patologico di inizio della malattia e la progressione di risoluzione, il tutto in un soggetto singolo animale. Questo approccio è uno strumento prezioso per ottenere comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base dell'immunità cellulare alle infezioni e come queste stesse risposte, se non correttamente regolata, può portare a malattie infiammatorie e autoimmuni. In definitiva, un quadro dettagliato del comportamento dei leucociti in vivo sarà di aiuto nello sviluppo di nuove terapie per il trattamento di malattie infiammatorie e infettive.
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Disclosures
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato di studi su animali della Washington University di St Louis.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01-3155-53502 e Washington University-Pfizer accordo Ricerca Biomedica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
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