Summary
هنا ، نحن تصف غير الغازية ثنائية الفوتون نهج المجهري (2P) لدراسة الكريات البيض صاروخ موجه في قاطع الطريق الماوس. نحن مناقشة الجوانب التقنية لدينا نسيج التحضير والتصوير والمشي القارئ من خلال تجربة نموذجية من الأولية التي أنشئت لتنفيذ وجمع البيانات.
Abstract
ثنائي الفوتون (2P) المجهري هو التصوير عالية الدقة التقنية التي تم تكييفها على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء. قيمة المجهري 2P هو أنه يقدم معلومات غنية spatiotemporal بشأن السلوكيات داخل أنسجة الخلايا في فئران سليمة وحية. التوظيف الكريات البيض تلعب دورا هاما في الدفاع المضيف ضد العدوى وعندما لم يتم التحقق منه ، يمكن أن تسهم في الأمراض الالتهابية والمناعة الذاتية. دراسة الكريات البيض في الجسم الحي التوظيف يشكل تحديا تقنيا منذ خلايا تتحرك بسرعة داخل الأوعية تقع عميقا داخل أنسجة تشتت الضوء. حتى الآن ، ومعظم الدراسات التصوير intravital الجراحية تتطلب تحضيرا لفضح الأوعية الدموية والأنسجة. لتجنب تلف الأنسجة والالتهابات الناجمة عن الجراحة نفسها ، وهنا ، نحن تصف غير الغازية نهج التصوير وحيدة الخلية والتي يمكن استخدامها لدراسة الكريات البيض في الاتجار قاطع الطريق الماوس والسلاميات. نحن مناقشة الجوانب التقنية لدينا 2P التحضير والتصوير والمشي القارئ من خلال تجربة نموذجية من الأولية التي أنشئت لتنفيذ وجمع البيانات.
Protocol
1. الحيوان التحضير :
هذا البروتوكول يستخدم الكبار البالغات LysM - eGFP الفئران ، والتي هي fluorescently المسمى العدلات والضامة عن طريق التعبير عن eGFP 1.
- وسم الأوعية الدموية :
لتصور الأوعية الدموية ، 15μl الكم من النقاط غير المستهدفة (655nm) والمخفف الى 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحقن في الوريد إلى 10-30 دقيقة الماوس قبل التصوير. - التخدير :
- ضع الماوس في غرفة تحريض النظام استنشاق التخدير البيطري (نوبل الخدمات الطبية ، وشركة).
- تعيين المرذاذ إلى 3-4 ٪ Isoflurane والناقل للغاز الأكسجين 100 ٪ معدل التدفق إلى ~ 1 لتر / دقيقة. لمنع جرعة زائدة عرضية التخدير ، وتراقب عن كثب هذا الحيوان حتى يتم فقدان قرصة إصبع القدم الخلفية المنعكس.
- الحفاظ على التخدير 1.5 ~ 2 ٪ Isoflurane وصقلها خلال التصوير لتقليل الآثار التنفس عند الضرورة. ويتم رصد معدل التنفس من الفأرة بعناية طوال الدورة التصوير لتأمين طائرة كافية من التخدير.
- يتم تطبيق Puralube مرهم البيطرية للعيون لمنع جفاف.
- يتم وضع الماوس على تنظيم 36 درجة مئوية وسادة التدفئة (برينتري العلمية) خلال الحقن والتصوير ومنع انخفاض حرارة الجسم.
- لمنع الجفاف ، وتعطى الماوس ميكرولتر من 100 SC PBS كل 1-2 ساعات.
- تقديم حافز التهابات للحث على تجنيد الكريات البيض :
- ضع الماوس على مرحلة الجراحة ومسحة من قاطع الطريق مع الايثانول 70 ٪.
- ثني إبرة حقنة الانسولين ~ 90 درجة بالقرب من شطبة لتسهيل الحقن وتحسين دقة وعمق التسليم.
- تحميل المحاقن مع 0.5 ميكروغرام من القولونية bioparticles مخففة في برنامج تلفزيوني 1μl. ويمكن القيام بذلك في غطاء أنبوب microfuge لجعله أسهل لتحميل الحبرية.
- الاستمرار على القدمين مع ملقط المنحنية وادخال الإبرة من الجلد بلطف مع شطبة تواجه التصاعدي حتى يتم فقط تحت الجلد.
- حقن ببطء وعقد في المركز لمدة 5 ثوان لمنع أي تدفق الى الوراء.
2. التصوير مرحلة الإعداد :
منصة التصوير يتكون من لوحة الألومنيوم مع وجود ثقب دائري قطع طريق المركز. يتم لصقها على الزجاج غطاء كبير في الجزء السفلي من لوحة وغير لاصق من المطاط يا الدائري في أعلى لإنشاء غرفة السائل محكم راحة لاستيعاب مخلب الخلفي. واستعد لوحة الألومنيوم إلى 36 درجة مئوية خلال عناصر التدفئة الملحقين الجزء العلوي من لوحة.
- ضع الماوس على مرحلة ما قبل التصوير وتحسنت الحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر الأساسية باستخدام الاحترار 36 درجة مئوية وسادة.
- تأمين مخلب إلى ساترة للغرفة التصوير مع طبقة رقيقة من superglue.
- غسل مخلب مرتين لإزالة أي بت العائمة من الغراء ثم ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني جديد (قبل تحسنت إلى 36 درجة مئوية).
ولا يمكن تصوير الفئران لمدة تصل إلى 4 ساعات من دون جدوى تضم الحيوان. يمكن أن يكون الإفراج القدم بلطف مع كمية صغيرة من الأسيتون والفئران إحياء للدراسات طولية التصوير. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، فإننا نوصي فترة التصوير لساعات 2 <والانتظار 24-48 ح بين الدورات لتقليل خطر جرعة زائدة من المخدر او الجفاف.
3. التصوير اكتساب
المجهر ثنائي الفوتون (2P المجهر) المستخدمة في هذا البروتوكول هو مبنية خصيصا المزدوج الليزر الفيديو نظام سعر تتكون المجهر تستقيم. وقد تم تجهيز النظام مع اثنين تي : ليزر الياقوت ، وأربعة وجها لوجه بي القلوي فرق إدارة المشاريع PMT للقناة في وقت واحد اقتناء 3 و 4 وغمر المياه 20X الهدف (أوليمبوس ، 20x/0.95 NA).
- توليف XR الحرباء تي : الياقوت الليزر (المتماسك شركة) إلى 900nm - 890.
- استخدام المرايا مزدوج اللون 480nm 560nm و(SemRoc) للفصل بين ثلاث قنوات : الأزرق (<480 نانومتر ، والثانية إشارة الجيل التوافقي) ، والأخضر (480 - 560nm ، LysM - eGFP العدلات إيجابية) والحمراء (> 560 نانومتر ، والكم نقطة الأوعية الدموية المسمى ). بدلا من ذلك ، يمكن استبدال المرشح 560nm 570nm مع مرشح للتمييز E. bioparticles القولونية (576nm bioparticles ستظهر البرتقالي) من نقاط الكم 655nm (سوف يظهر أحمر عميق).
- انخفاض بعناية الهدف في برنامج تلفزيوني ، والتركيز على متن سفينة من أخمص قدميه.
- مع سرعة التشغيل في صورة حيازة معدل الفيديو (30f/sec) واستخدام الإشارة الثانية التوافقي المنبثقة من الكولاجين والأنسجة معلما ، والمسح بسرعة النسيج (على سرعة اقتناء الفيديو معدل) لتحديد وعاء دموي من الفائدة (واحد بالمعتدلات lysM - eGFP مرئية).
- تعديل على كسب هذه الفرق لتحسين فصل الألوان وتقليل كمية الليزر اللازمة لتحقيق إشارة كافية على خلفية (سواءالحرص على عدم تشبع الصورة!).
- مرة واحدة تقع المنطقة مجال المصالح ، تبدأ الوقت الفاصل بين التصوير. لا يمكن أن يؤديها الوقت الفاصل بين التصوير مع القرارين الزمنية المختلفة. المتداول الخلية التصوير والالتصاق وفي الوقت الحقيقي داخل الأوعية الدموية ، ونحن اكتساب 30f/sec على طائرة واحدة - Z. لتوثيق الخلية التسرب والهجرة في لحمة نقوم 3D الوقت الفاصل بين التصوير. وهناك بروتوكول نموذجي يتكون من اقتناء المتوسط 15 لقطة لكل خطوة Z - 21 ، واكتساب 2.5μm متتابعة ض الخطوات لحجم 200-225 50μm على فترات 30 ثانية.
- مرة واحدة يتم تخزين ملفات البيانات على الخادم المختبر ، ويمكن استخدام Imaris Volocity أو البرمجيات لأداء متعددة الأبعاد وجعلها خلية تتبع 2 ، 3.
4. ممثل النتائج
1.Real الوقت (30f/sec) تخيل العدلة من المتداول على طول هذه السفن في 200X. الفاصل الزمني يبين التصوير العدلات ، والخضراء ، والمتداول على طول بطانة الأوعية الدموية حول 10mins بعد الإصابة بفيروس Listeria monocytogenes ، كما هو مبين في الحمراء. ألياف الكولاجين في النسيج الضام يظهر باللون الأزرق. الرجاء النقر هنا لمشاهدة الفيديو.
2.Time مرور 3D التصوير ديناميات التوظيف في العدلة 200X. ويرد التوظيف العدلة نموذجية من التداول ، والهجرة من خلال الأنسجة الملتهبة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول الفيديو نظهر إجراءات التصوير 2P غير الغازية من الكريات البيض في التوظيف استجابة للالتهاب.
وقاطع الطريق هو موقع الكلاسيكية الفسيولوجية لدراسة التهاب مثل مرض الحساسية ، والعدوى والمناعة الذاتية 4-7. 2P التصوير يقدم صورة مفصلة لخطوات متميزة في مسارات الاتجار الكريات البيض ، والمتداول من التصاق في الأوعية الدموية لالكيميائي لمواقع ظيفة المستجيب. لقد وجدنا أن الكريات البيض يختلف التوظيف استجابة لأنواع مختلفة من المحفزات للالتهابات. وينبغي اختيار جرعة من التحفيز بعناية وجعل كل محاولة لإهانة ألخص الفسيولوجية. إذا كانت الجرعة عالية جدا أو تسليمها إلى موقع غير الفسيولوجية ، قد تطغى على التحفيز المضيف أو يؤدي إلى إنتاج الأعمال الفنية التجريبية والظواهر الشاذة. نوصي جرعات معاير من المحفزات للتجارب الرائدة المقترنة مع عنصر تحكم مناسب وباستخدام إبرة عازمة على زيادة حجم ودقة على حد سواء تسليم وعمق الحقن. فمن المهم أيضا أن يمكن من موقع الحقن يقع بسهولة ، وخاصة بالنسبة للتجارب التصوير التسلسلي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حقن في مكان معين (أي ، والثانية مكونة على أخمص القدمين الخلفيتين مخلب الثالث من اليمين) أو عن طريق الوشم على الجلد وحقنه في مكان قريب.
2P التصوير يوفر فرصة فريدة لتصور وظيفة الكريات البيض الاتجار المستجيب في الجسم الحي. غالبية التصوير intravital الأساليب المستخدمة لدراسة الكريات البيض التوظيف تتطلب جراحة لفضح الأنسجة والأوعية الدموية في 80-10 تخدير الفئران. الجراحة نفسها يستحث الالتهاب الذي سيؤثر السلوك الكريات البيض. ومع ذلك ، 2P التصوير يسمح درس الكريات البيض غير جراحية وعلى قرار وحيد الخلية في عمق النسيج 3D البيئة الأصلية. علاوة على ذلك ، منذ إجراء التصوير في حد ذاته لا يضر الماوس ، فإنه هو خيار ممتاز لإجراء دراسات طولية لنماذج من السرطان والتهاب المفاصل. 2P التصوير لديه القدرة على تقديم وعرض لم يسبق له مثيل من عملية بدء المرض من المرض وتطور الى قرار ، في إطار موضوع الحيوان الفردية. هذا النهج هو أداة قيمة للحصول على نظرة ثاقبة الآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء الحصانة الخليوي الى العدوى وكيف يمكن لهذه الاستجابات نفسه ، إذا ينظم بشكل غير صحيح ، قد يؤدي إلى الأمراض الالتهابية والمناعة الذاتية. في نهاية المطاف ، فإن صورة تفصيلية للسلوك الكريات البيض في الجسم الحي أن تساعد في تطوير علاجات جديدة لعلاج الأمراض الالتهابية والمعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أجريت جميع التجارب وفقا لبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الدراسات الحيوانية من جامعة واشنطن في سانت لويس.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - 3155-53502 واشنطن اتفاق بحوث الطبية الحيوية جامعة فايزر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A. Allergy in experimental mouse tuberculosis. Am Rev Tuberc. 72, 171-195 (1955).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13313-13318 (1998).
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
