Summary
We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.
Abstract
Twee-foton (2P) microscopie is een hoge resolutie imaging techniek die heeft over het algemeen aangepast door biologen. De waarde van 2P microscopie is dat het rijk spatiotemporele informatie met betrekking tot het gedrag binnen de cel intact weefsels en in levende muizen biedt. Leukocyten werving speelt een belangrijke rol in de afweer tegen infecties en wanneer aangevinkt, kan bijdragen aan inflammatoire en auto-immuunziekten. Studeren leukocyten rekrutering in vivo is technisch een uitdaging, omdat cellen zijn snel, die zich binnen schepen diep in lichtverstrooiing weefsels. Tot op heden zijn de meeste intravitale imaging studies vereisen chirurgische voorbereiding op de bloedvaten en weefsel bloot te leggen. Om te voorkomen dat de weefselbeschadiging en ontsteking veroorzaakt door een operatie zelf, hier, beschrijven we een niet-invasieve single-cell imaging aanpak die kan worden gebruikt om witte bloedcellen handel in de muis voetzool en vingerkootjes te bestuderen. We bespreken de technische aspecten van onze 2P imaging voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.
Protocol
1. Dier voorbereiding:
Dit protocol maakt gebruik van volwassen vrouwelijke volwassen LysM-eGFP muizen, waarin de neutrofielen en macrofagen fluorescent zijn gelabeld door de expressie van eGFP 1.
- Labeling bloedvaten:
Om dit te visualiseren bloedvaten, 15μl van de niet-gerichte quantum dots (655nm) worden verdund in 100 pi PBS en intraveneus geïnjecteerd in de muis 10-30 min. voor beeldvorming. - Anesthesie:
- Plaats de muis in de inductie kamer van het veterinair inhalatie-anesthesie-systeem (Noble Medical Service, Inc).
- Stel de verdamper tot 3-4% isofluraan en de 100% zuurstof draaggasstroom tarief ~ 1 L / min. Om te voorkomen dat per ongeluk een overdosis narcose, nauwlettend toezien op het dier tot aan de achterste teen knijpen reflex is verloren.
- Anesthesie wordt gehandhaafd op 1,5 ~ 2% isofluraan en afgestemd tijdens de beeldvorming aan de ademhaling artefacten te minimaliseren als nodig is. De ademhaling van de muis is zorgvuldig gecontroleerd gedurende de beeldvorming sessie om een adequaat niveau van anesthesie te verzekeren.
- Puralube veterinaire zalf wordt toegepast op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- De muis wordt geplaatst op een gereglementeerde 36 ° C verwarmen pad (Braintree Scientific) tijdens de injecties en imaging en om onderkoeling te voorkomen.
- Om uitdroging te voorkomen, wordt de muis krijgt 100 pi PBS sc elke 1-2 uur.
- Het leveren van een inflammatoire stimulans om leukocyten recruitment veroorzaken:
- Plaats de muis op de operatie podium en uitstrijkje van de voetzool met 70% ethanol.
- Buig de naald van een insulinespuit ~ 90 graden de buurt van de schuine kant aan de injectie te vergemakkelijken en verbeteren van de precisie van de levering diepte.
- Plaats de spuit met 0,5 ug van E.coli bioparticles verdund in 1μl PBS. Dit kan gedaan worden in het deksel van een microfugebuis om het gemakkelijker maken om de druppel laden.
- Houd de teen met gebogen pincet en voorzichtig breng de naald door de huid met de schuine naar boven tot hij net onder de huid.
- Injecteer langzaam en zijn plaats te houden gedurende 5 seconden om te voorkomen dat terug te spoelen.
2. Imaging stadium setup:
De imaging platform bestaat uit een aluminium plaat met een rond gat door het centrum. Een grote dekking van glas is gelijmd aan de onderkant van de plaat en een rubberen O-ring is gelijmd op de top om een vloeistofdichte verzonken kamer te creëren aan de achterzijde poot tegemoet te komen. De aluminium plaat is opgewarmd tot 36 ° C via twee verwarmingselementen aan de bovenkant van de plaat.
- Plaats de muis op de voorverwarmde imaging podium en in stand houden van de muis kerntemperatuur van het lichaam met behulp van de 36 ° C opwarming pad.
- Bevestig de poot aan de dekglaasje van de beeldvorming kamer met een dunne film van superlijm.
- Was de poot twee keer om een drijvend stukjes lijm te verwijderen en vervolgens de kamer vullen met verse PBS (voorverwarmd tot 36 ° C).
Muizen kunnen worden afgebeeld voor maximaal 4 uur zonder bestaande uit het dier de levensvatbaarheid. De voet kan voorzichtig worden vrijgegeven met een kleine hoeveelheid aceton en muizen weer tot leven voor longitudinale imaging studies. Maar in dit geval raden wij de beeldvorming periode tot <2 uur en 24-48 uur te wachten tussen de sessies om het risico van anesthesie overdosering of uitdroging te minimaliseren.
3. Imaging Acquisition
De twee-foton microscoop (2P microscoop) die in dit protocol is een custom-built dual-laser video-rate systeem, bestaande een rechtop microscoop. Het systeem is uitgerust met twee Ti: Sapphire lasers, vier hoofd-op Bi-alkali PMT's voor gelijktijdige 3 en 4 kanaals acquisities en een 20x water immersie objectief (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Stem de Chameleon XR Ti: saffier-laser (Coherent Inc) naar 890-900nm.
- Gebruik 480Nm en 560nm dichroïsche spiegels (SemRoc) tot drie kanalen scheiden: blauw (<480 nm, tweede harmonische generatie signaal), groen (480-560nm, LysM-eGFP positieve neutrofielen) en rood (> 560 nm, quantum dot gelabeld bloedvaten ). Als alternatief kan de 560nm filter worden vervangen door een 570nm filter om E. te onderscheiden coli bioparticles (576nm bioparticles zal verschijnen oranje) van 655nm quantum dots (verschijnt diep rood).
- Voorzichtig lager de doelstelling in het PBS en de focus op een schip van de teen.
- Met het beeld overname snelheid van werken op video-rate (30f/sec) en het gebruik van de tweede harmonische signaal afkomstig van collageen als een tissue oriëntatiepunt, al snel het weefsel onderzoek (in video-rate overname speed) om een bloedvat van belang (een te lokaliseren met zichtbare LysM-eGFP neutrofielen).
- Stel de winst op de PMT's om kleurscheiding te optimaliseren en het minimaliseren van de hoeveelheid van de laser nodig is om voldoende signaal te bereiken op achtergrond (zijnZorg dat u de afbeelding te verzadigen!).
- Zodra gebied regio van belang is gevestigd, begint time-lapse imaging. Time-lapse imaging kan worden uitgevoerd met twee verschillende temporele resolutie. Voor beeldvorming cel rollen en adhesie en in real-time in de bloedvaten, verkrijgen we 30f/sec op een enkele z-vlak. Voor het documenteren van cellen extravasatie en migratie in het parenchym voeren we 3D time-lapse imaging. Een typische overname protocol zal bestaan uit een gemiddelde van 15 frames per Z-stap en het verwerven van 21 opeenvolgende 2.5μm z-stappen voor een volume van 200 tot 225 50μm bij 30 sec.
- Zodra de data bestanden worden opgeslagen op de server lab, kan Imaris of Volocity software worden gebruikt om de multi-dimensionale rendering en mobiele tracking twee, drie uit te voeren.
4. Representatieve resultaten
1.Real-time (30f/sec) verbeelding van de neutrofielen rollen langs de schepen op 200x. Time lapse imaging shows neutrofielen, in groene, glooiende langs het endotheel van bloedvaten ongeveer 10 minuten na infectie met Listeria monocytogenes, weergegeven in het rood. Collageen vezels in het bindweefsel worden weergegeven in het blauw. Klik hier om de video te zien.
2.Time-lapse 3D-beeldvorming van neutrofielen werving dynamiek op 200x. Typische neutrofielen werving uit de circulatie en migratie door ontstoken weefsel wordt weergegeven. U kunt hier klikken om de video te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video protocol tonen we de procedures voor niet-invasieve beeldvorming van 2P leukocyten rekrutering in reactie op de ontsteking.
De voetzool is een klassieke fysiologische site voor het bestuderen van ontsteking, zoals allergie, infectie en auto-immuunziekte 4-7. 2P beeldvorming geeft een gedetailleerd beeld van de verschillende stappen in leukocyten mensenhandel wegen, uit te rollen en de hechting in de bloedvaten te chemotaxis naar sites van effector functie. We hebben gevonden dat de leukocyten werving varieert in reactie op de verschillende soorten van inflammatoire stimuli. De dosis van de stimulus moet zorgvuldig worden gekozen en elke poging gedaan om een fysiologische belediging samenvatten. Als de dosis te hoog is of geleverd aan een niet-fysiologische site, kan de stimulans overweldigen de host of leiden tot experimentele artefacten en produceren abnormale verschijnselen. Wij raden getitreerde doses van stimuli voor proefprojecten gecombineerd met een geschikte controle en met behulp van een gebogen naald aan de precisie van zowel de geleverde volume en de diepte van de injectie te verhogen. Het is ook van cruciaal belang dat de plaats van injectie kan gemakkelijk worden gelokaliseerd, in het bijzonder voor seriële imaging experimenten. Dit kan worden bereikt door het injecteren op een specifieke locatie (dat wil zeggen, tweede cijfer op de derde teen van rechts achterpoot) of door tatoeage van de huid en het injecteren in de buurt.
2P imaging biedt een unieke gelegenheid om leukocyten mensenhandel en effector functie in vivo te visualiseren. De meerderheid van de intravitale imaging methoden gebruikt om de leukocyten werving studie een operatie nodig om weefsels en bloedvaten bloot in verdoofde muizen 8-10. De operatie zelf veroorzaakt ontsteking die leukocyten gedrag impact. Echter, 2P imaging maakt het mogelijk leukocyten te onderzoeken niet-invasieve en op single-cell resolutie diep in de native 3D-weefsel-omgeving. Aangezien de imaging-procedure zelf niet schadelijk voor de muis, het is een uitstekende keuze voor het uitvoeren van longitudinale studies voor modellen van kanker en artritis. 2P beeldvorming heeft het potentieel om te bieden en ongekende weergave van een ziekteproces aan de ziekte van initiatie en progressie naar resolutie, alles binnen een individueel dier te onderwerpen. Deze aanpak is een waardevol instrument voor het verkrijgen van inzicht in de cellulaire en moleculaire mechanismen die de cellulaire immuniteit voor infecties, en hoe deze zelfde reacties, indien niet goed geregeld, kan leiden tot ontstekingen en auto-immuunziekten ten grondslag liggen. Uiteindelijk zal een gedetailleerd beeld van het gedrag van leukocyten in vivo worden steun in de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van ontstekings-en infectieziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Washington University in St Louis.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01-3155 tot 53.502 en de Universiteit van Washington-Pfizer Biomedical Research overeenkomst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A. Allergy in experimental mouse tuberculosis. Am Rev Tuberc. 72, 171-195 (1955).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13313-13318 (1998).
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
