Summary
γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。
Abstract
DNA二本鎖切断（DSB）は、内因性（生理学的または病理学的）プロセスによって、または外因性の因子、特に電離放射線と放射線作用の化合物のいずれかによって発生する可能性、特に致命的と遺伝毒性病変、です。セリン- 139残基が、高度に保存されたC末端SQEYのモチーフで、γH2AXを形成し、DNA二本鎖切断に早い応答であるにH2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化
Protocol
組織
- 最適な切削温度（OCT）コンパウンド4583で金型に組み込まれた肺組織は、、CMライカ1950クライオスタットを用いて、ポリ- L -リジンスライド上にマウントされている（5μm）を切片であった。
凍結サンプルは、マードック児童研究所で博士サイモンロールスロイスから得られた。肺組織は、未処理のBalb / cマウス由来とヒトの喘息6の病理学的特徴の多くを示す慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルから得られた。動物実験は科学的な目的のために実験動物の管理と利用の実践のためのオーストラリアのコードに準拠しているマードック児童研究所の動物倫理委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
- セクションは、1時間室温で風乾させた。
免疫蛍光染色
- セクションは、2％（w / v）のリン酸のパラホルムアルデヒドで20分間緩衝生理食塩水（PBS）で固定した。
- のセクションでは、15分ごとにPBSで2回洗浄と平衡化した。
- セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄した20分間70％エタノール（-20℃に冷却）で処理した。
この時点で、スライドは最大2週間まで4℃で密閉容器で保存することができる。
- セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄し、次いで新鮮PBS含む0.5％のTween - 20及び0.1％トリトンX - 100室温で1時間（PBS - TT）の8％BSAを含むPBSで調製された100μLでブロックされた。
すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施した。 - セクションは、5分間PBS - TTで洗浄し、疎水性の境界は、パパニコロウペンを持つ組織の周囲にマークされました。
- 過剰なバッファがオフチップを渡したされ、一次ウサギポリクローナル抗γH2AX抗体（PBS中の1％BSAで、1:500に希釈し、ミリポア）100μlのは、室温で2時間のインキュベーションのために各セクションに追加されました。
一次抗体とのインキュベーションを4℃で一晩実施されることがあります
さらなる証拠を、γH2AX病巣がDSBのを表していること、DSBの修復のタンパク質を認識する一次抗体を使用してもよい。例えば、γH2AXとリン酸化ATMの共局在は、一般的に使用される組み合わせです。 - 暗所で室温で1時間、セクションが各5分間PBS - TTで2回洗浄し、二次抗体液100μl（Invitrogen社のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGを1％BSAで、1:500に希釈）とともにインキュベートした。 （希釈した抗体は、プロシージャ全体で暗所で保管された）。
- セクションは、各5分間PBS - TTで3回洗浄し、37℃で30分のため0.5mg/mL RNアーゼA℃でインキュベートした。
- 対比と取り付けの核はヨウ化プロピジウムを含むVectashieldの培地で行った。
- スライドはマニキュアで密封し、℃の暗所での分析の前に4℃で一晩保存した。
顕微鏡/分析
- （ - のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGγH2AXのため）とPI（543 nm）のレーザーツァイスLSM510のメタ共焦点顕微鏡は、標準的なGFPを使用して画像を取得するために使用されていました。
画像は、0.5μmのステップサイズとZシリーズのパターンで獲得されました。分析中に、個々の面は、デコンボリューションと巣の重複を最小限に抑えるために最大限の投影画像を生成するために積層した。
前の粒子数の最大値投影画像を作成する方法は、薄切片（例えば、5μm以下）を使用し、バックグラウンド染色はわずかですどこにされる状況でのみ使用する必要があります。ここで、重要なバックグラウンドを持つ厚いセクションがBolteとCordelieresで説明されているように、このような3Dオブジェクトカウンタなど、より複雑な分析を分析する必要があります（2006年）7を使用する必要があります。
- Metamorph（Molecular Devices社、米国）は、病巣の数を定量するためにマージ（赤と緑）の画像を作成するために使用されました。
Metamorphが巣の数を定量化するために使用できますが、組織切片を使用して、通常、時病巣は、より高い精度のために（目で）手動でカウントされます。
興味の特定の細胞型は、インスタンスの肺上皮細胞のために、定量用に選択することができます。これは、組織学上及びヘマトキシリン及びエオシン染色連続切片への参照を持つ基づいて行われることがあります。
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Discussion
このデモンストレーションの目的のために我々は、未処理のBalb / cマウスからと慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルからマウスの肺組織を使用する。我々は、未処理のセクションに比べて損傷した肺で観察されたわずかに高い平均で細胞あたりの巣の数の違いを定量。特に、定量はそれぞれ、未処理組織と慢性アレルギー性気道疾患の組織で、/セルあたり6.5巣および/セルあたり9.4巣（セクションあたり20細胞の手動カウント）を示した。しかし、DSB誘発剤の使用は、マウスの肺モデルにおいてDSBのを誘導することが知られている例のナフタレン、のために、より高い病巣の番号を生み出しています。確かに、このプロトコルは、ほとんどの組織での電離放射線の影響の調査に適しています;γH2AX巣数と解像度の点でより顕著な結果は、電離放射線が使用されているときに得られる。これはよくX線への暴露は、急速にγH2AX巣の形と病巣の番号は30〜60分2との間で最大に達することが知られている。したがって、1時間の時点（照射後）は、初期のDSBの形成とDNA修復を監視するために使用することができる長い時間（通常は最大48時間）の評価に最適です。
全体的に、組織におけるγH2AXの定量は、DSBの形成と修復を監視する場合に便利です。電離放射線の文脈におけるその有用性から離れて、方法は、DSB -誘発様々な組織における化合物は、例えば、例えばドキソルビシンなどの一般的に使用される抗癌アントラサイクリンは、DSBのを引き起こすことが知られているの有効性の評価に適用することができます、そして潜在的に監視する活性酸素種を介したDSBのを特徴としている様々な病態。重要なのは、このプロトコルは、異なるマウス組織に適しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。 MMTは、国立衛生研究所から博士オルガSedelnikovaから専門家の援助とアドバイスに感謝しています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
