Summary
डीएनए γH2AX foci के आधार पर डबल भूग्रस्त टूटता quantitation एक अमूल्य उपकरण बन गया है, ऊतक radiosensitivity और विकिरण संशोधित यौगिकों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए विकिरण जीव विज्ञान में, विशेष रूप से,. यहाँ हम γH2AX foci के ऊतकों के नमूनों में quantitation के लिए एक immunofluorescence परख का उपयोग प्रदर्शित करता है.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) विशेष रूप से घातक और genotoxic घावों, कि या तो अंतर्जात (शारीरिक या रोग) प्रक्रियाओं के द्वारा या exogenous कारकों, विशेष रूप से विकिरण और radiomimetic यौगिकों द्वारा पैदा कर सकते हैं कर रहे हैं. H2A histone संस्करण, H2AX सेरीन-139 अवशेषों पर, की phosphorylation उच्च संरक्षित सी टर्मिनल SQEY आकृति में γH2AX बनाने, कतरा डीएनए डबल टूटता एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया है
Protocol
ऊतकों
- फेफड़े ऊतक, इष्टतम काटने (अक्टूबर) तापमान 4583 यौगिक में molds में एम्बेडेड (5 सुक्ष्ममापी) sectioned मुख्यमंत्री Leica 1950 cryostat का उपयोग किया गया था और पाली - एल lysine स्लाइड्स पर घुड़सवार.
डॉ. साइमन रॉयस से जमे हुए नमूने मर्डोक बच्चों अनुसंधान संस्थान में प्राप्त किया गया. फेफड़े ऊतक इलाज Balb / ग चूहों से और जीर्ण एलर्जी वायुमार्ग रोग है जो मानव 6 अस्थमा के रोग सुविधाओं के कई शो की एक माउस मॉडल से प्राप्त हुई थी . जानवरों पर प्रयोग मर्डोक बच्चों अनुसंधान संस्थान है जो वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए अभ्यास के ऑस्ट्रेलियाई कोड का पालन करता है के पशु आचार समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
- धारा कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सूखी हवा की अनुमति दी गई.
Immunofluorescence धुंधला
- धारा 2 (w / v)% फॉस्फेट में paraformaldehyde 20 मिनट के लिए खारा (पीबीएस) buffered के साथ तय किया गया.
- धारा 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो पीबीएस में washes के साथ equilibrated थे.
- धारा 20 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन पीबीएस में washes के द्वारा पीछा किया मिनट के लिए 70% इथेनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस को ठंडा) के साथ इलाज किया गया.
इस बिंदु पर स्लाइड सील कंटेनरों में 4 ° C में किया जा सकता है 2 सप्ताह के लिए संग्रहीत.
- धारा पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया और 10 मिनट के लिए फिर 100μL हौसले पीबीएस में तैयार पीबीएस 0.5% बीच-20 और 0.1% से युक्त में 8% BSA युक्त के साथ अवरुद्ध कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक्स 100 (पीबीएस टीटी) ट्राइटन .
सभी incubations एक humidified धुंधला गर्त में प्रदर्शन किया गया. - धारा PBS-TT के साथ 5 मिनट के लिए धोया गया और एक hydrophobic परिधि के ऊतकों के आसपास एक पैप कलम के साथ चिह्नित किया गया था.
- अतिरिक्त बफर दूर tipped था और प्राथमिक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी γH2AX एंटीबॉडी (1:500 पीबीएस में 1% BSA में, पतला, Millipore) के 100μl, कमरे के तापमान पर एक 2 घंटे ऊष्मायन के लिए प्रत्येक अनुभाग में जोड़ा गया है.
प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन 4 रातोंरात प्रदर्शन हो सकता है डिग्री सेल्सियस
आगे सबूत के लिए, कि γH2AX foci DSBs का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक प्राथमिक DSB मरम्मत प्रोटीन पहचानने एंटीबॉडी भी इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, γH2AX और phospho - एटीएम सह स्थानीयकरण एक आमतौर पर इस्तेमाल किया संयोजन है. - धारा PBS-TT में दो बार धोया गया 5 मिनट के लिए और माध्यमिक एंटीबॉडी के (Alexa Fluor 488 बकरी आईजीजी विरोधी खरगोश पतला 1:500, 1% BSA में, Invitrogen) 100μl के साथ incubated कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में . (पतला एंटीबॉडी प्रक्रिया भर अंधेरे में रखा गया था).
- धारा तीन बार PBS-TT के साथ धोया गया 5 मिनट प्रत्येक के लिए और 37 में 30 मिनट के लिए 0.5mg/mL RNase एक डिग्री सेल्सियस के साथ incubated
- परमाणु counterstaining और बढ़ते Vectashield मध्यम युक्त propidium आयोडाइड के साथ प्रदर्शन किया था.
- स्लाइड्स नेल पॉलिश के साथ सील किया गया और 4 में रात भर विश्लेषण से पहले डिग्री सेल्सियस अंधेरे में संग्रहीत.
/ माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
- (Alexa Fluor 488 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी γH2AX के लिए) और PI (543 एनएम) पराबैंगनीकिरण एक Zeiss LSM510 मेटा confocal खुर्दबीन मानक छवियों का उपयोग GFP प्राप्त करने में इस्तेमाल किया गया था.
छवियाँ 0.5 सुक्ष्ममापी के एक कदम के आकार के साथ एक पैटर्न Z श्रृंखला में हासिल किया गया. विश्लेषण के दौरान, व्यक्तिगत विमानों deconvoluted थे और अधिकतम अनुमानित छवि उत्पादन foci के ओवरलैप को कम करने के लिए खड़ी है.
अधिकतम अनुमानित छवि एक कण गिनती से पहले बनाने की विधि केवल परिस्थितियों में जहाँ एक पतली अनुभाग (5μm उदाहरण के लिए) का उपयोग किया है और जहां पृष्ठभूमि धुंधला नगण्य है में किया जाना चाहिए. कहाँ एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि के साथ मोटा वर्गों का विश्लेषण किया जाना चाहिए, 3 डी ऑब्जेक्ट काउंटर जैसे एक और अधिक जटिल विश्लेषण Bolte और Cordelieres (2006) द्वारा वर्णित के रूप में 7 इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- Metamorph (आण्विक डिवाइसेज, संयुक्त राज्य अमेरिका) के विलय छवियों (लाल और हरे रंग) को बनाने के लिए foci के संख्या quantitate इस्तेमाल किया गया था.
हालांकि Metamorph foci संख्या quantitate, आमतौर पर जब ऊतक foci मैन्युअल रूप से गिने जाते हैं (आँख) के द्वारा अधिक से अधिक सटीकता के लिए वर्गों का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हित के विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं quantitation के लिए चयनित किया जा सकता है उदाहरण के फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं के लिए. ऊतक विज्ञान पर और haematoxylin और eosin दाग धारावाहिक वर्गों को संदर्भ के साथ आधारित किया जा सकता है.
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Discussion
हम अनुपचारित Balb / ग चूहों से और जीर्ण एलर्जी वायुमार्ग रोग के एक माउस मॉडल से माउस फेफड़े के ऊतकों का इस्तेमाल इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए. हम foci के संख्या में सेल के प्रति थोड़ा अधिक अनुपचारित वर्गों की तुलना में क्षतिग्रस्त फेफड़ों में मनाया औसत के साथ मतभेद quantitated. विशेष रूप से, quantitation / सेल प्रति 6.5 foci और 9.4 प्रति सेल / foci (खंड 20 प्रति कोशिकाओं के मैनुअल गिनती) का संकेत है, इलाज के ऊतकों और जीर्ण एलर्जी वायुमार्ग रोग ऊतक में क्रमशः. हालांकि, DSB उत्प्रेरण एजेंट का उपयोग, उदाहरण नेफ़थलीन, जो माउस फेफड़ों के मॉडल में DSBs प्रेरित करने के लिए जाना जाता है के लिए, उच्च foci संख्या उपज होगा. दरअसल, इस प्रोटोकॉल के सबसे ऊतकों में विकिरण के प्रभाव की जांच के लिए उपयुक्त है, γH2AX foci संख्या और संकल्प के मामले में अधिक हड़ताली परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब विकिरण का प्रयोग किया जाता है. यह सर्वविदित है कि एक्स - रे के लिए निम्नलिखित जोखिम, γH2AX foci तेजी फार्म और foci संख्या 30-60 2 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँच है. इसलिए, 1 घंटे का समय अंक (के बाद विकिरण) प्रारंभिक DSB गठन और अब (आमतौर पर 48 घंटे) बार डीएनए की मरम्मत की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मूल्यांकन के लिए आदर्श होते हैं.
कुल मिलाकर, γH2AX के ऊतकों में quantitation DSB गठन और मरम्मत की निगरानी के लिए उपयोगी है. विकिरण के संदर्भ में इसकी उपयोगिता के अलावा, विधि DSB-उत्प्रेरण विभिन्न ऊतकों में यौगिकों, उदाहरण के लिए डॉक्सोरूबिसिन रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया विरोधी anthracyclines DSBs कारण जाना जाता है की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है, और संभवतः पर नजर रखने के लिए विभिन्न विकृतियों कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की मध्यस्थता DSBs द्वारा विशेषता है. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल अलग माउस ऊतकों के लिए उपयुक्त है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था. एमएमटी विशेषज्ञ और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से डॉ. ओल्गा Sedelnikova से सहायता और सलाह के लिए आभारी है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
