Summary
O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.
Abstract
Imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP-FCM) é um método eficiente para a detecção e quantificação de interações proteína-proteína. O princípio básico que se estende de ELISA sanduíche, onde o analito capturado primária pode ser detectado em conjunto com outras moléculas associadas fisicamente dentro de complexos multiprotein. O procedimento envolve o acoplamento covalente de microesferas de látex de poliestireno com immunoprecipitating anticorpos monoclonais (mAb) específico para uma proteína de interesse, incubando estas contas com lisados celulares, sondagem complexos de proteína capturadas com fluorocromo-sondas, e análise de talão associado fluorescência por citometria de fluxo. FCM-IP é extremamente sensível, permite a análise de proteínas em sua nativa (não-desnaturado) do estado, e é passível de qualquer análise semi-quantitativa ou quantitativa. Como vantagens adicionais, IP-FCM não requer engenharia genética ou equipamentos especializados, além de um citômetro de fluxo, e pode ser facilmente adaptado para aplicações de alto rendimento.
Protocol
** Este protocolo de vídeo é baseado em uma publicação associada 1: alta sensibilidade de detecção e análise quantitativa dos nativos interações proteína-proteína e complexos multiprotein por citometria de fluxo. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE da ciência 2007 (389): PL2, 05 de junho de 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. Clique aqui para ver esta publicação .
Antes de iniciar, preparar o seguinte stock Soluções aquosas:
| MES tampão de acoplamento: | Armazenar a 25 ° C |
| MES, pH 6,0 | 50 mM |
| EDTA | 1 mM |
| Têmpera / Bloqueio / Storage (SBQ) Buffer: | Armazenar a 4 ° C |
| BSA | 1% |
| Azida de sódio | 0,02% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
| Tampão FCM: | Armazenar a 4 ° C |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 100 mM |
| Azida de sódio | 0,02% |
| FBS | 5% |
| PBS, pH 7,4 | 1x |
Prepare imediatamente antes da utilização:
| EDAC-MES: | Dissolver 50 mg / mL em pó EDAC MES tampão de acoplamento |
| Digitonina solução (2% w / v): | Dissolva o pó digitonina em dH 2 O por aquecimento a 95 ° C por 5min, em seguida de resfriamento em gelo |
| Tampão de Lise: | |
| Tris, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mm |
| Solução digitonina | 1% |
| Inibidores da Protease | 1x |
| Manter no gelo |
1. Acoplamento de mAb de Contas
- Determinar a concentração de contas do estoque adquirido por diluindo em PBS e contando com um hemocitômetro. Comece com uma diluição de 1:10000 de contas para a contagem.
- Pipetar 18 x 10 6 contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Lavar as contas 2 a 3 vezes em 0,5-1,0 mL de buffer Coupling MES, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem.
- Volte a suspender as contas em 50 mL de buffer Coupling MES.
- Ativar os grupos carboxila nas contas de adição de 20 mL de recém-preparados EDAC-MES.
- Misture delicadamente por 15 min a 25 ° C por manualmente pipetando para cima e para baixo.
- Lave as contas ativadas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem.
- Volte a suspender as contas ativadas em 50 mL de PBS.
- Adicionar 50 mL do mAb IP (a concentração de ações 0,2-1,0 mg / mL) à solução ativada talão.
- Misture por 3 a 4 horas a 25 ° C, colocando o tubo em um shaker vibrando. Agitar o suficiente para impedir que a resolução das esferas no fundo do tubo.
- Lavar mAb-coupled contas 2 a 3 vezes em 0,5 a 1,0 mL PBS, centrifugação a 20.000 g por 3 minutos a 25 ° C após cada lavagem.
- Volte a suspender as contas em 100 mL de buffer SBQ. Estes podem ser armazenados a 4 ° C.
- Suspendendo as contas assim, diluir 1:200-1:10,000 em PBS e contar com um hemocitômetro. A concentração deve ser medido para cada lote preparativa, de modo que o número de contas utilizadas em cada experimento IP ou pull-down pode ser controlada com precisão.
2. Pós-nuclear Preparação Lysate e Ip
O método de lise e as condições de lise vai depender do tipo de célula e interações proteína-proteína em análise. Uma série de protocolos existem e podem ser modificados para sua aplicação.
- Lyse 20 x 10 6 'pequena' células, como linfócitos, ou 5 x 10 6 'grande' células, como macrófagos ou células tumorais, em 100 mL de buffer Lysis fresco em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 20min no gelo. Escala o volume de lise, conforme necessário.
- Para remover núcleos e restos celulares insolúveis, centrifugar o lisado em 20.000 g por 10 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante e descartar o pellet.
- Adicionar 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-coupled contas ao lisado clarificado, pipetagem cuidadosamente para misturar. O volume mínimo que usamos pararealizar um único IP está a 5 mL.
- Coloque em uma roda giratória verticais 4 horas durante a noite em uma sala fria. Definir a velocidade suficiente para impedir as contas de liquidação. É aceitável que o líquido de baixo volume de IPs para permanecer no fundo do tubo durante a rotação.
3. Sondagem da Bead-capturado Protein com fluorocromo-Anticorpos
- Lave as contas IP duas vezes em 0,2-1,0 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem.
- Volte a suspender as contas em 100 FCM Buffer e alíquota 20 mL mL em cada um dos cinco ou mais tubos de 1,5 mL de microcentrífuga ou poços de uma placa de fundo da chaminé.
- Adicionar fluorocromo-mAbs às amostras. Executar a FCM mancha de acordo com instruções do fornecedor ou de acordo com as concentrações de determinados empiricamente. Como ponto de partida, adicione 0,2-1 mL de solução anticorpo estoque (em 0,2-1,0 mg / mL) por tubo ou bem, e incubar por 40 min no gelo.
- Lavar sondado contas em 1,5 ml tubos duas vezes em 1,0 mL de buffer FCM gelada, centrifugação a 20.000 g a 4 ° C por 3 min após cada lavagem. Remova cuidadosamente o sobrenadante após cada lavagem, tendo o cuidado para não perturbar as contas. Por um prato de chaminé inferior, lave duas vezes com 0,2 mL gelada buffer FCM, centrifugação a 1000g por 5 min a 4 ° C após cada lavagem. Um pipetador multicanal é útil para esta etapa. Para remover o sobrenadante de contas em um prato fundo da chaminé, 'filme' da placa de uma vez, então, ainda de cabeça para baixo, blot qualquer pinga das bordas dos poços. O volume residual em cada poço, contendo as contas, serão cerca de 20 mL.
- Volte a suspender as contas em 200 mL de buffer FCM por amostra. Transferência para tubos rotulados FACS. Amostras estão agora prontos para FCM.
4. FCM Aquisição
As contas CML descritos neste protocolo são 3-5 m de diâmetro, aproximadamente metade do diâmetro de um linfócito do mouse quiescente. Portanto, pode ser necessário aumentar manualmente o Forward Scatter (FSC) ganho ampères e Side Scatter (SSC) de tensão para que a população de eventos talão de registrar em escala. Contas individuais IP devem formar uma única população bem agrupado. As configurações e portão deve ser ajustado para excluir doublets talão e detritos.
- Antes de contas correntes ou padrões de talão, remova o adaptador de contenção de gotículas que circunda a entrada da amostra em alguns citómetros. Permitir que o fluido bainha a escorrer entre as amostras, pois isso irá limpar a entrada e evitar contas de serem transitadas de uma amostra para outra.
- Use contas sem rótulo, um controle negativo de fluorescência, e Partículas Calibração Rainbow (PCRs), um controle positivo de fluorescência, para ajustar as configurações de modo que ambos os extremos negativos e positivos de fluorescência aparecem simultaneamente no log escala de eixo-x. Isso garante que a fluorescência das amostras experimentais também será on-escala. Note-se que PCRs são menores do que as contas da CML, para FSC e SSC parâmetros, bem como a posição portão, pode precisar ser temporariamente alteradas para que a amostra.
- Return to-grânulo unlabeled configurações vez de calibração com PCRs é completo. Se apenas uma sonda fluorescente por amostra é usada, nenhuma compensação de fluorescência é necessário. Em geral, complexos multiprotein sonda com um único fluorocromo-mAb por amostra FCM, e examinamos vários parceiros de interação através da coloração paralelo amostras talão com mAbs específicos para as subunidades diferentes.
- Adquirir e salvar arquivos de fluorescência de dados. Análise pode ser realizada utilizando software citometria de fluxo, tais como CellQuest, programa FlowJo, ou cflow.
5. Resultados representante
Figura 1. Células IP FCM para TCR/CD3 complexo multiprotein. T a partir da estirpe camundongo BALB / c foram lisadas em digitonina 1%, eo lisado foi submetido a IP-FCM usando anti-CD3ε contas. Os complexos capturado contidas quantidades significativas de TCR-β (região roxo) e co-associados CD3-ε (verde), mas perto dos níveis de fundo (definida pela sonda imunoglobulina irrelevante, rosa trace) de outras proteínas, como Thy1.2, CD45, ou H-2K (d) (marrom, laranja e vestígios azul, respectivamente). Veja resultados semelhantes publicados anteriormente 1-6.
Discussion
Informações sobre interações proteína-proteína é altamente relevante para a análise de muitos processos celulares, tais como transdução de sinal, a maturação linhagem, progressão do ciclo celular, apoptose e cascatas. FCM-IP oferece uma maneira rápida, quantitativa e sensíveis para analisar a interação de proteínas e definir os membros de complexos multiprotein em sua conformação nativa. Esferas podem ser acoplados e incubadas com lisados celulares em um dia e pode ser sondado e analisadas no dia seguinte. Um formato de placa de 96 poços permite um grande número de amostras a serem analisadas de uma só vez para a coleta de dados eficiente para fins estatísticos ou de triagem. Usando fluorescentes padrões talão, o número de proteínas capturados por cada talão pode ser estimada. Muito pouco material de origem é necessária para a captura e detecção, de forma limitada e amostras de analitos escassos ainda podem ser analisados para múltiplas interações. Apesar de IP FCM-não requer engenharia genética, epítopo-tagging, desnaturação, ou in-vitro mistura de proteínas em um ambiente não-fisiológica, pode ser acoplado com estas e outras técnicas, tornando-se um instrumento valioso e acessível, com aplicabilidade a muitos sistemas biológicos.
Solução de problemas:
Muitos IP-FCM experimentos geram dados de interação de proteínas úteis na primeira vez que são tentados. Entretanto, a otimização da FCM-IP pode melhorar a conjugação de anticorpos para contas, captação de proteínas complexas, e sonda fluorescente vinculativo.
A eficiência de conjugação de anticorpos IP pode ser determinada pela sondagem contas acoplado diretamente com um anticorpo anti-imunoglobulina. Se essa eficiência é baixa, aumentando a concentração de anticorpos durante a reação de acoplamento podem permitir mais anticorpos IP para anexar a cada esfera. Isto pode aumentar a capacidade de ligação do lote IP talão, resultando na captura avançada e detecção de analitos. Outros primário-amina contendo moléculas (por exemplo, Tris, albumina de soro bovino) não deve estar presente durante a reação de acoplamento, uma vez que estas possam competir com o mAb para talão de fixação, resultando em acoplamento mAb baixo. Se conjugação de mAb aos grânulos prova problemático por outros motivos, ao invés contas pode ser acoplado a avidina / estreptavidina, e anticorpos biotinilados pode, posteriormente, ser não-covalente e usado para immunprecipitation.
Apesar de conjugação de anticorpos boa, a detecção inicial de talão associado fluorescência pode ser baixo. Captura, primeiro complexo em si pode ser baixa. Porque o IP-FCM depende da concentração de analitos, aumentando o número de células lisadas por volume de unidade de lise pode aumentar a captura e detecção do analito. Além disso, a captura pode ser aumentada pela diminuição do número de contas IP incubadas com o lisado, que distribui complexos capturado em contas de menos, e resulta em aumento de fluorescência média por talão quando sondada. Em segundo lugar, é possível que o acesso do anticorpo sonda para os complexos capturada é estericamente impedidas pelo anticorpo immunoprecipitating. Neste caso, o problema pode ser resolvido utilizando anticorpos diferentes para capturar e / ou sonda.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Inovação Eagles (Ordem Fraternal de Eagles) e pela Fundação Mayo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
